蛋白质间相互作用研究方法1
LY: 宋体; mso-ascii-font-family: 'Times New Roman'; mso-hansi-font-family: 'Times New Roman'">融合蛋白进行Far Western印迹来检测蛋白质-蛋白质相互作用
放射标记蛋白探针的制备
1．在微量离心管中制备下列反应混合物：
[γ-32P] ATP（6000 Ci/mmol） 5μl
蛋白激酶A 1 unit/μl
在谷胱甘肽琼脂糖上的GST融合蛋白 1～3μg
2×PK缓冲液 12.5μl
水 到25μl
反应混合物在37℃孵育30 min。
2．标记反应完成后，加入200μl的1×PK缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠，然后在微量离心机上以最大速度离心1 min。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去，再重复清洗一次。
3．用一种蛋白酶切下标记蛋白质，或用20mmol/L还原型谷胱甘肽于50mmol/L Tris (pH8.0)中，将标记GST融合蛋白从琼脂糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。
4．在标记反应前如果标记蛋白与GST成分分开，就将标记蛋白上用1×PK缓冲液平衡的Sephadex G-50柱，以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开，就可使用。将标记蛋白放在冰盒中，在同一天使用。
探测膜
5．用标准技术将蛋白质转移到膜上，制备待检测的膜。
6．用碱性缓冲液完全覆盖膜并在4℃轻轻振荡清洗10min。
7．弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在4℃轻轻振荡孵育4 h过夜。
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