选择重组蛋白表达的合适方法（二）
三、毕赤酵母
酵 母 作 为 另 一 种 表 达 重 组 蛋 白 的 强 有 力 的 传 统 工 具 ，已 被 成 功 应 用 于 大 量 蛋 白 质 的表 达 。酵 母 既 具 有 大 肠 杆 菌 的 许 多 优 点 ，如 增 殖 时 间 短 、基 因 组 易 于 操 作 ，又 具 有 真 核 生物 的 优 势 ，包 括 改 善 的 蛋 白 质 折 叠 的 能 力 和 大 部 分 的 翻 译 后 修 饰 能 力 。第 一 个 常 规 应 用于 重 组 蛋 白 表 达 的 酵 母 菌 株 是 酿 酒 酵 母（SaccAarow^yces ceretw』 siae) (Strausberg andStrausberg, 2001)。然 而 ，近 1 5 年 来 ，毕 赤 酵 母 (Pz’ c/iia和u ‘ f o r k ) 已 经 成 为 酵 母 的 首选 , 因 为 该 菌 株 重 组 蛋 白 的 表 达 水 平 高 于 酿 酒 酵 母 (详 见 第 1 3 章）。毕 赤 酵 母 是 甲 醇 营 养型 酵 母 (methyltropic yeast), 可 利 用 甲 醇 作 为 其 唯 一 的 碳 源（Cregg et al. , 1985)。毕 赤酵 母 在 含 甲 醇 的 培 养 基 中 生 长 ，会 导 致 其 醇 氧 化 酶 (alcohol oxidase，A 0 X )和 二 羟 丙 酮 合酶 (dihydroxyacetone synthase)基 因 发 生 强 烈 的 诱 导 转 录（C r e g g ，2007)。经 过 诱 导 ，这些 蛋 白 质 可 以 占 到 毕 赤 酵 母 总 生 物 质 的 3 0 % 。研 究 人 员 将 醇 氧 化 酶 I (A O X l ) 的 严 密调 控 的 强 启 动 子 整 合 入 大 部 分 重 组 蛋 白 表 达 质 粒 用 来 驱 动 重 组 蛋 白 的 表 达 ，已 经 实 现 了对 该 甲 醇 依 赖 基 因 诱 导 作 用 的 利 用（Daly and H e a m , 2005)。毕 赤 酵 母 的 表 达 载 体 会 整合 到 基 因 组 中 ，而 酿 酒 酵 母 的 表 达 载 体 是 游 离 复 制 (replicating episomally)的 质 粒 型 表 达载 体 ，这 种 载 体 很 不 稳 定 。利 用 毕 赤 酵 母 评 估 重 组 基 因 的 表 达 需 要 3〜 4 周 ，这 包 括 酵 母的 转 化 、筛 选 阳 性 整 合 的 转 化 子 和 蛋 白 质 的 表 达 所 需 的 时 间 。毕 赤 酵 母 一 个 能 打 动 人 的优 点 是 其 在 合 适 的 培 养 条 件 下 能 够 获 得 极 高 的 细 胞 密 度 (C r e g g , 2007)。只 需 使 用 成 本低 廉 的 培 养 基 ，毕 赤 酵 母 就 能 达 到 120 g /L 的 细 胞 干 重 密 度 。需 要 重 点 注 意 的 一 点 是 ，诱导 用 培 养 基 中 需 要 含 有 低 百 分 比 的 甲 醇 ，在 大 规 模 培 养 中 ，甲 醇 的 量 达 到 了 产 生 火 灾 风 险的 程 度 ，需 要 采 取 更 高 一 级 的 安 全 措 施 。
毕 赤 酵 母 已 经 用 于 获 取 胞 内 和 分 泌 表 达 的 蛋 白 质 。与 其 他 真 核 生 物 一 样 , 它 可 以 有效 地 形 成 二 硫 键 ，而 且 已 经 成 功 用 于 表 达 含 有 多 个 二 硫 键 的 蛋 白 质 。为 了 便 于 分 泌 表 达 ,必 须 对 重 组 蛋 白 进 行 改 造 以 使 其 携 带 信 号 肽 序 列 。最 常 用 的 信 号 肽 是 酿 酒 酵 母 的 cr交配 因 子 (a-mating factor)的前-原(pre-pro)序 列（Daly and H e a r n , 2005)。 由 于 毕 赤 酵 母只 分 泌 很 少 的 内 源 性 蛋 白 ，从 培 养 基 中 纯 化 重 组 蛋 白 是 个 相 对 简 单 的 工 作 。如 果 重 组 蛋白 的 酶 解 比 较 严 重 ，可 以 利 用 Pep4 蛋 白 酶 缺 陷 型 毕 赤 酵 母 菌 株 进 行 表 达 (Gleeson et al. ，1998)。该 菌 株 具 有 较 低 的 液 泡 肽 酶 A (vaCU〇 k peptidase A )活 性 ，该 酶 负 责 活 化 羧 肽 酶Y(carboxypeptidase Y )和 蛋 白 酶 B K p r o t e a s e B I ) 。
酵母具有翻译后在特异的天冬酰胺残基(N-连接)和丝氨酸/苏氨酸残基(〇■连接)添加聚糖 (glycan)的能力。这些聚糖的结构与昆虫和哺乳动物细胞修饰添加的聚糖的结构是很不相同的。在毕赤酵母中，N-连接的聚糖是高甘露糖(mannose)型 的 ，通 常 有 8〜17个甘露糖，而酿酒酵母聚糖含有50〜150个甘露糖残基(Celik et al. ， 2007; Gemmill andTrimble, 1999)。与昆虫和哺乳动物细胞相似的是，在 酵 母 中 N-连接聚糖的一致序列是Asn-Xaa-Ser/Thr。有两个研究小组已经通过全面的工程改造获得了两个毕赤酵母的菌株 ，它们能够产生可以与哺乳动物细胞中相媲美的复杂的 N-连 接 聚 糖 结 构（Hamiltonand Gerngross, 2〇 07)。然而, 其他研究人员只能使用Roland Contreras研究小组开发的菌株，而且必须得到Research Corporation Technologies的许可。对 毕 赤 酵 母 中O■连接聚糖的结构研究还不很充分，但已知其是通过在丝氨酸/苏氨酸残基上添加1〜4 个甘露糖残基形成的（Goto, 2007; Trimble et al.， 20 〇 4)。已有数个报道指出，某些特定蛋白质在毕赤酵母中表达时会被添加O 连接聚糖，而在哺乳动物细胞中的内源性表达却不会这样（Daly and Hearn， 2005)。
四、杆状病毒/昆虫细胞
在昆虫细胞中由杆状病毒(baculovirus)介
导的蛋白质表达为重组蛋白制备提供了另外一种手段(详 见 第 14章）。杆状病毒是一种裂解性的（lytic) 、大的（130 k b )双 链 D
N A病毒 ，其中桃木菌属(Awi呀 病 毒 是 最 常 用 于 重 组 蛋 白 表 达 的 杆 状 病毒
。杆状病毒通常在来源于秋天彳了军虫草地贪夜蛾（fall a r m y w o r m Spodoptera frugiperda )(Sf 9
、Sf 2 1 ) 的昆虫细胞系中进行增殖, 而重组蛋白的表达既可在上述细胞系中完成，也可在来源 于拟尺罐粉纹 夜 蛾（cabbage
looper Tii) 的 细 胞（H i g hFive)中进行(Kost etal. ，
2〇〇5)。起初，构建重组杆状病毒的工作涉及将具有杆状病毒
D N A 侧翼序列的目标 基 因 与杆状病毒的D N A
共转染昆虫细胞(insect cell) , 然后筛选出稀 有 的 同源重组体。重组体的鉴定是通过筛选形态改变的空斑(plaque)来
实现的，而且通常需要另外的多轮空斑筛选以确保制备的重组病毒中未污染有野生型病毒。这种耗时耗 力
的重组病毒制备方法在大多数时候已经被位点特异性转座技术(Bac^to-Bac或 Ba c uIoDirect, Invitrogen) 和改 良
的 同源重组 技 术 (该 技 术 使 用 在 orfi62 9 含有一个致死突变的工程杆状病毒）（来自 Oxford Expression
Technologies 的 flashBAC, 或来自 E M D ——N o -v a g e n 的 B a c M a g i c )
所取代。因为其重组效率为 100%, 这两种方法都省略了分离空斑的操作。1 轮 或 2
轮的重组病毒扩增后，研究人员可以使用空斑分析法、更新颖更快速的实时定量 PC R法或基于抗体的分析法对杆状病毒的浓缩液进行定量（Hitchm a
n et al. ，2007; K w o n et a l .， 2〇
02)。重组杆状病毒构建和定量方法上的进步已经极大地减少了使用杆状病毒进行表达的时间—- 缩短至大约3 周
，这其中包含为了优化表达而耗费的时间。
杆状病毒表达系统中最常用的是polH 启 动 子 和 plO启 动 子 ，二者均能在杆状病毒感染的晚期经诱导产生高水平的表(Ikonomou e t a l . ， 2003)。在此阶段, 细胞开始死亡 ，并伴随着蛋白酶的释放，这些蛋白酶可能会导致重组蛋白降解。为了减少重组蛋白的酶解，已经使用了在细胞裂解周期中较早阶段激活的启动子，如基本启动子（basic prom oter) (Ikonomou et al. ， 2003) 。 CA£A 和1)——〇1执基因分别编码几丁质酶（chitinase) 及一种组织蛋白酶(cathepsin protease)，也可以通过构建二者的基因缺陷型以尽量降低蛋白质水解的作用（Monsma and Scott, 1997)。
杆状病毒介导的蛋白质表达通常既能用于制备胞质表达的重组蛋白，又能用于获取分泌表达的重组蛋白。高效的分泌表达一般需要信号肽的参与。昆虫和哺乳动物的信号序列都能引导重组蛋白进入昆虫细胞的分泌途径。起初 ，昆虫细胞的培养是在含血清的培养基中进行，这使分泌蛋白的纯化变得复杂。近来新研发的培养基允许使用动物组织或植物组织的蛋白质水解液代替血清，从而大大简化了蛋白质的纯化 (Ikonomou et al. ，2003)。不过 ，这种特殊的培养基造价高昂，限制了它在大规模生产中的应用。
昆虫细胞能有效地在重组蛋白中形成二硫键，也能进行绝大部分发现于哺乳动物细胞的翻译后修饰。然而，大部分昆虫细胞中形成的JV-连接聚糖都是岩藻糖苷寡甘露糖(fucosylatedpaucimannose)结 构（Man3 GlcNAc2-N-A sn) (H arrison and Jarvis, 200 6;Jenkins e ta l. ，1 9 % ) 。这一发现促使人们于最近构建了能够产生含有常见于哺乳动物细胞中的复杂N -连接聚糖的糖蛋白的昆虫细胞系（Harrison and Jarvis, 2006)。一个能够表达数种糖基转移酶的转基因 S f-9 昆 虫 细 胞 系 已 实 现 了 商 业 化（Mimiccelllin eInvitrogen), 其产生的 N -连接聚糖包含一个双触须样唾液酸化(sialylated)结构。目前仅有几篇文献描述了昆虫细胞产生的O 连接聚糖的结构(Chen et a l . ， 1991; Sugyiama eta l . ， 1993; Thomsen et a l . ， 2004)。
