副溶血性弧菌核酸检测试剂盒使用说明
副溶血性弧菌核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）
◆ 产品说明
致病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于副溶血性弧菌的检测。检出限为103 CFU/ml。
◆ 产品组成（96测试）
011032LⅡ | |
试剂 | 含量 |
A-VP-P | 20μL × 8管× 12排 |
NG-P | 100μl× 3支 |
PG-VP-P | 100μl× 2支 |
◆ 适用仪器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：模板添加区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》中的5.1或其他标准处理样品，对样品进行前增菌，制备的菌液保存待用。
称取 25 g（ml）样品放入盛有225 ml BPW 的无菌均质杯中，以8000 rpm/min～10000 rpm/min均质1 min～2 min，或置于盛有225 ml BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定 pH 值，用 1 mol/ml无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.8 ± 0.2。无菌操作将样品转至 500 ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 ℃±1 ℃培养 8 h～18 h。
如为冷冻产品，应在45 ℃以下不超过15 min，或2 ℃～5 ℃不超过18 h 解冻。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
2．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-VP-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。
按下列条件设置扩增反应：
PCR循环 | 荧光收集位点 | ||
95℃ | 3分钟 | 1个循环 | — |
94℃ | 5秒 | 40个循环 | — |
60℃ | 40秒 | ※ |
4.基线和阈值设定
基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。
◆ 结果判定
检测样品无Ct值或≥40.0，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有副溶血性弧菌或含量低于检测限；
检测样品Ct≤35.0，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有副溶血性弧菌；
检测样品35.0＜Ct＜40.0，需进行一次重复实验，若Ct值≥40.0则为阴性，否则为阳性。
NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线且Ct值＜30，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
