实质等同性（转录组学）实验（一）
实验材料 小麦
试剂、试剂盒 β-巯基乙醇氯仿异戊醇SSTE 缓冲液
仪器、耗材 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验步骤
3.1 芯片背景
我们使用了 19846 个点，包含 9246 个 Unigene 序列的小麦 cDNA 芯片（http://www . cerealsdb. uk. net/index. htm) 用于详细的转录组研究 [3 ] 。重复的 unigene 集合阵列点到了 Codelink 活化芯片上（Amersham Biosciences Ltd, UK ) 。
芯片杂交用与 aa- dUTP- cDNA 样品荧光标记染料反向的染料——Alexa 荧光染料 555 和 647。杂交在转基因系 （B 102-1- 1、B1118-8-4 或 B1355-4-2 ) 和其原始非转基因系 ( L 88-31 或 Cadenza ) 之间的两个胚乳发育阶段（开花后 14 天和 28 天，dpa ) 和叶片 ( 发芽后 8 天，dpg ) 成对比较 [5]。每个材料取样 3 次，检测 2 次。
cDNA 芯片的优势是经济实惠，并允许使用者完全控制内容和设计（定制芯片）。相反，Affymetrix 寡核苷酸芯片更加灵活，它是单染料系统，使试验更简单、更特异(提高对类似的异构体和多基因家族成员的识别能力），提供更量化和易比较的数据。GeneCMp 基因组芯片，采用了一套能匹配任何转录序列的 25 碱基寡核苷酸“探针”。以小麦芯片为例，每组探针有 11 个，多数与组装的序列表达标签（ EST ) 的公共保守域序列一致。因此，在 cDNA 芯片中，每一组探针对应的是许多 EST，而不是单个的 EST。为了识别不同的转录本，同时满足其他条件，如 GC 含量相对一致，探针通过程序自动化设计。对于一个目标转录本，设计了 一个完全匹配的探针（perfect matches，PM ) 、一个单碱基错配探针（mismatches，MM ) ，这样能对非特异杂交有一个估计和矫正。然而，对于 MM 探针的真正信号值存在争论，许多广泛使用的分析方法不用 MM 探针（ 见 3.10节）。短 探针（ 如 25-mer) 对于序列相似的转录本更有效，因为单个碱基错配足够使杂交不稳定，而且固定长度使得杂交条件可以标准化，以满足所有探针；相反，较长的可变长度的探针，比如那些 cDNA 芯片平台使用的探针，将不可避免与任何与其部分序列相似性探针杂交，所以其真实信号集成了几个不同的转录分子。
3.2 植物材料和生长条件
转录组比较研究使用了三个六倍体转基因面包小麦的胚乳和叶片。转基因小麦品系 B102 -1-1 ( L 88-31 背景） [ 6, 7 ]
和 B1118-8-4 ( Cadenz 北背景）[ 5 ] 由基因枪共转化两个质粒产生[ 14 ] 。一个质粒是 p1Axl 质粒 [ 13
] ，含有由自身的胚乳特异启动子驱动的高分子质量谷蛋白亚基 1AX1 ( Glu-M ) 基因； 另一个质粒含有选择基因bar 和标记基因
uidA，由玉米泛素启动子驱动。转基因系 B1355-4-2 [ 5 ] 也来自 Cadenza，共转化获得只含 IAX1 基因和 bar
基因编码序列的“干净”片段。一个常规育种系 L88-18 [ 9 ] 是 L88- 31 的姐妹系，也用于转录组比较。两个常规育种系 ( L
88-31、L 88-18 ) 和转基因系（B 102-1-1 ) 的转录组两两比较是：B 102-1-1与 L 88-31、L 88-18与 L
88-31、 B 102-1-1与 L 88-18。转化方法的比较，即 “干净”片段与整个质粒的比较：B1355-4-2 与
Cadenza、 B1118-8-4 与 Cadenza、 B1355-4-2 与
B1118-8-4。本研究所用的不同面包小麦携带的相关基因成分的详细信息见表15 . 1 。
( 1 ) 植物种在平衡行列设计的盆钵中，每个处理（小麦生长发育阶段）有 3 个生物学重复。
( 2 ) 开花后 14 天和 28 天胚乳，取样的植物每盆种 2 株。每一株只保留 2 个分蘖。选中的盆钵（本试验为 3 个生物学重复）包括用于发芽后第 8 天取叶片的第三株植物。
( 3 ) 每天观察穗，一旦发现中央小穗开花就做标记。
( 4 ) 在无菌条件下，手工从颖果剥离种子胚乳；每盆只从 2 个穗子的中部分别取至少 24 枚胚乳为一个样品。
( 5 ) 样品都是一天中同一时间取样，以避免昼夜节律的影响。
3.3 SDS-PAGE
通过谷粒总蛋白 SDS-PAGE 凝胶电泳，检测所有小麦系的高分子质量亚基蛋白的表达（图 15. 1 ) ，使用 10% ( m/V) 丙烯酰胺凝胶和 Tris-硼酸缓冲液系统 [ 10 ] 。
