实质等同性（转录组学）实验（四）
3.9 芯片数据介绍
对简单的实质等同性实验来说，一个比较转基因系与对照之间基因表达的散点图就已足够了。文献 [ 5 ] 中参与两个实验的样品都标注在图15. 2中。结果用 GeneSpring 软件包显示，绘制了每组比较小麦系之间每个基因成对的平均强度，并突出显示少数感兴趣的基因（统计上显著差异表达）。结果也在表15 . 2 中作了数值化总结。
结果表明，转基因并未影响显著数量的内源性基因的表达，转基因植物实质等同于其相应的非转基因对照或亲本[ 5 ] 。结果也证实了转化方法（ 如干净片段或者整个质粒）对基因表达模式影响不大。实质等同性实验强调统计上的严谨性，对 cDNA 芯片来说 ，考虑诸如染料偏好性和芯片空间变异等的问题（ 见注20，目前 cDNA 芯片实验数据分析的评价）。
对于简单的实质等同性实验而言，一张简单的比较转基因系和对照系之间表达的散点图就可以了，更复杂的设计可能需要其他的显示方式。无论是 cDNA、寡核苷酸芯片或者其他平台，分层聚类是一种有力的转录组数据概览方法 [16]。这种方法将有基因关联表达的样品和（或）基因分组，不同的关联程度以树状图可视化。它通常是以热图样式显示的：基因树在一边，样品树在另一边，颜色代表基因的表达量。如果检测到处理对表达有影响，不同处理的样品会表现为不同的分支，所有重复出现在这些分支内的叶片上；在另一维，不同表达的基因也会聚在一起。
基因表达谱的非分层聚类方法，如 K 均值、质量阈值（QT ) 和自组织映射等也是常用到的。基因簇的平均表达值可以简化转录组数据。共表达意味着共同的转录调控和潜在的功能关系。进一步检查基因簇内基因，以确定是否有任何共同的已知功能（如蛋白质储存、应激反应或防御），或参与共同途径。对于作物如小麦中的绝大多数基因，功能只可能从序列相似性推测。聚类分析，显示和注释工具可以在开放资源 [ 如 Bioconductor (http://www .bioconductor .org / ) ] 和商业软件包 [ 如 GeneSpring (AgilentTechnologies, Inc) ] 获得。
3.10 分析小麦基因芯片背景
这里概述了 Affymetrix 基因芯片表达分析应遵循的步骤。详细的标准流程可以在“ Affymetrix 基因表达分析技术手册”中查询（见注 21 ) 。
基因芯片探针芯片是由 Affymetrix 公司制造的（见注 22) 。现在许多大学和私入公司已全面配备 Affymetrix Gene Chip TM 芯片平台，为客户提供各种芯片检测过程服务（GeneChip芯片探针购买、cDNA 标记、芯片杂交、扫描、芯片分析等）。
Affymetrix Wheat Gene Chip 芯片由 AffymetrixGene Chip Consortia Program 制造，包含了 61127 套探针，代表小麦基因组所有 42 条染色体上 55052 个转录本。芯片是基于 GenBank 和 dbEST ( http://www.affymetrix.com/community/research/consortia .affx ) 上发表的功能域数据设计的。小麦基因组芯片可用于不同小麦种的基因表达研究： UniGene Build 38，2004 . 4 . 24 ) 。该芯片包含了至 2004 年 5 月，所有这些种的 EST 和全长序列设计的探针。
GeneChip 探针芯片制造过程结合了光刻和化学合成技术。1.7cm2 的芯片上有几万到几十万个不同的寡核苷酸探针，每个探针点（探针室）20 mm。每一个目标转录组由一套长度 25 个碱基的 11 个 PM 和 11 个 MM 探针来检测。这些 PM 和 MM 探针（探针对）位置彼此相邻。基因表达水平可以用 Affymetrix 软件通过 PM 和 MM 探针之间亮度差异来计算（见注22) ，或者只用 PM 探针的亮度计算（RMA 和 gcRMA 分析）。
3.11 小麦基因芯片表达分析
3.11.1 RNA 样品准备
对于特定组织，RNA [ 总 RNA 或者提纯的 poly ( RNA species ) ] 提取和纯化可以采用已有的步骤（步骤与 3. 4节叙述的类似）。RNA 提取也有许多商业试剂盒可供选择。例如，TRIZOL - Reagent (Invitrogen ，见注2 3 ) 被推荐为小麦旗叶的总 RNA 提取方法。当提取物含有大量的糖蛋白和多糖时，标准步骤中匀浆（TRIZOLRNA提取说明步骤1 ) 和 RNA 沉淀（TRIZOLRNA 提取说明步骤 3 ) 需要略作修改。匀浆这一步，匀浆产物需要增加一步离心（见注 24) 。RNA 沉淀这一步，水相回收沉淀总 RNA 需要用异丙醇和高盐沉淀溶液（见注 25) 。为了得到高纯度 RNA ( 特别是 A260/A230。比值 >1.8)，我们还建议 RNA 过 RNeasy 柱（Qiagen，见注26 ) 洗涤。RNA 清理建议放在总 RNA 样品中去除基因组 DNA 之后进行（见 3.4 节）。核酸浓度和质量分别用 Nanodrop ND 1000 分光光度计和 Aglient 2100 生物分析仪（RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies , Palo，Alto，CA , USA ) 检测（见注 16)。
3.11.2 cDNA 合成和标记（见注 27 )
从总 RNA [ 或者纯化的 poly ( A ) RNA ] 合成双链 cDNA，然后生物素标记的 cRNA 由 cDNA 体外转录。与基因探针芯片杂交前，发现 cRNA 片段对于最高灵敏度是很关键的。
3.11.3 杂交（见注 28)
准备杂交混合物包括 cRNA 片段和探针芯片对照。与探针芯片杂交，孵育 16 h。
3.11.4 探针芯片洗脱与染色
( 1 ) 流体工作站（fluidic station ) 的设置： 流体工作站是用于芯片洗脱和染色的。它是通过兼容 PC 工作站上 GeneChip Operating System ( GCOS ) /Microarray Suite 操作的。步骤包括设置和启动流体工作站（见注 29 和注 30)。
( 2 ) 芯片的洗涤和染色（见注 31 ) : 16 h 杂交后，除去芯片上杂交液（ 见注 28) ，然后将芯片完全浸入适当体积推荐的清洗液（见注 31)。
3.11.5 芯片扫描（见注 31)
一旦扫描结束，每张完整的芯片图保存在一个以.dat 为扩展名、实验名字命名的文件。GCOS 采集和分析芯片图谱及实验数据：定义探针单元并计算每个单元的光强度 ( 见注 22) 。由于制造过程中的更高的质量控制，许多 cDNA 芯片图谱分析的问题，如空间变异对 Affymerix 芯片来说不用考虑（ 3.8 节）。产生了包含每一个 PM 和 MM 探针信号值的输出文件（cel 文件）。
3.12 小麦基因芯片数据分析
Affymetrix 公司芯片广泛用于许多种生物，人们投入了相当大的精力来开发和测试不同的方法分析信号，以寻找最好的基因表达检测方法。Affymetrix 开发的方法是以一组探针的 PM 和 MM 之间的平均差异来估计表达（ MAS5 ) 。然而，MM 信号值的有效性还有疑问，而且有一些替代的方法看起来事实上超过了 MAS5。RMA (robustmultichipaverage) 算法取一个实验的所有 PM 数据（如全部 cel 文件），不仅标准化每个芯片表达数据中位数，而且对每个芯片表达数据使用相同的方差 [17]。gcRNA 算法是 RMA 一个变种，它将每个探针的 GC 组成对信号贡献的权重考虑在内[18]。与其他方法相比，在标样 [ 19 ] 检测和实时反转录 PCR 定量 [ 20 ] 方面，它能很好处理 Affymetrix 芯片数据。gcRNA 算法可以使用开源的 Bioconductor 软件包（http :// w w w .bioconductor .org) 或者商业软件如 GeneSpring7 (Agilent Technologies, Inc) 。
一旦选择了表达检测方法（如 MAS5、RMA 、gcRNA 或者其他），接下来的分析是一样的，而非标准化数据（ 如 MAS5 ) 必须首先进行标准化（如除以每一个芯片表达值的中位数）。建议先筛选探针集，保留绝对表达值高于阈值（至少一个样品如此）的所有探针（可以从芯片中非小麦对照的信号判断）。这些探针进一步筛选那些表达差异在任何一对样品的阈值之上的；通常 1.4 倍的变化被认为是可以检测到的最小值。实质等同性实验设计通常有 2 个以上基因型，至少 3 次生物学重复。为了检测到基因型之间统计上显著差异表达的基因，对每个探针集的表达值的对数（它们通常呈对数正态分布）作方差分析 （ANOVA ) 。假定即使经过筛选，探针数量依然非常大，可以用多重检验校正。Benjamini-Hochberg 假阳性率（ FDR ) 校正 [ 21 ] 是不错的选择。对许多探针做经典的 P＜0.05 的方差分析和 Benjamini-Hochberg 多重检验校正，能够有大约 5% 的基因通过纯属偶然。然而，如果很少或根本没有基因通过此校正，可以取消多重检测，方差结果是假阳性率所致。例如，如果 1000 个探针 P <0.05 测验，50 通过了但没有多重检验校正，这只是不超过预计的运气。重要基因名单的实质等同性标准是与 cDNA 芯片实验相同的 [ 5 ] 。
