实质等同性（蛋白质组学）实验（三）
3.4 凝胶染色
为了用蛋白质组学研究 2D 胶上蛋白点，染色必须与质谱分析兼容，且灵敏度越高越 好。符合这些标准的染色法有好几种可供使用，包括胶体考染、某些银染和各种荧光染剂，如 Sypro Ruby、Orange、Deep Purple 和 Flamingo。胶体考染灵敏性不如银染和荧光染料，但是便于使用且相对便宜（见注 6 关于灵敏度部分）。银染是一种多步式的过程，但能使较低丰度蛋白显现。然而，由于没有终止点，高丰度蛋白 可能会过度着色。同时，银染的重复性可能不佳，因为染色程度取决于操作者。所有染色过程都需要在振荡器或摇床上进行，在染色/脱色过程中提供温和的振荡。
3.4.1 胶体考马斯亮蓝 G250
( 1 ) 在 50%（V/V）甲醇、10%（V/V）乙酸（或 TCA ) 中过夜固定凝胶。
( 2 ) 在胶体考马斯染料中染色（按照使用说明书用甲醇稀释）（Bio- rad；4 : 1 染料：甲醇）。
( 3 ) 用 25%（V/V）甲醇，7%（V/V）乙酸脱色 1~5 min。
( 4 ) 用 25%（V/V）甲醇脱色过夜，保存在水中。
3.4.2 银染（参照 [ 13 ])
( 1 ) 凝胶用 40%（V/V）乙醇、10%（V/V）乙酸（或 TCA）固定 30 min。
( 2 ) 置于“敏化液” 中 30 min：30%（V/V）乙醇，0.2% (m/V) 硫代硫酸钠 ( sodium thiosulphate ) ，0.5 mol/L 乙酸钠。
( 3 ) 用蒸馏水洗三次，每次 5 min。
( 4 ) 加入银溶液 [ 0.25%（m/V）硝酸银]，染色 20 min。
( 5 ) 用蒸馏水洗两次，每次 1 min。
( 6 ) 置于“显影液” 中：0.24 mol/L 碳酸钠，每升溶液加 200 μl 37% 甲醛 ( 0.0074% 终浓度）。
( 7 ) 溶液变得混浊或 10 min 后加入新鲜显影剂。继续显影直到达到所要求的染色程度。
( 8 ) 加入 0.04 mol/L EDTA 10 min 终止反应。
( 9 ) 用蒸馏水洗两次。
( 10 ) 保存在水中。
3.4.3 Sypro Ruby 蛋白染色
( 1 ) 胶用 40%（V/V）甲醇，10%（V/V）TCA 固定过夜（18 h ) 。
( 2 ) 用 Sypro Ruby 染料在暗处染色过夜。Sypro Ruby 是光敏感的，所以凝胶需要在暗室中处理，凝胶储存盒要盖上铝箔。
( 3 ) 凝胶用 10%（V/V）甲醇、6%（V/V）TCA 脱色。
( 见注 7 关于 Sypro Ruby 的使用和废液处理）
3.5 凝胶成像与分析
有不同厂商的成像系统可供使用。扫描仪必须具有高分辨率，如需进行凝胶斑点质谱分析，扫描仪还要与切点仪（spot picker) 结合。
同样的，有许多软件包可供使用，允许凝胶匹配，产生合成（或参照）凝胶。 斑点体积、峰高和峰面积也可通过不同程序包获得，因而能对处理进行比较。有必要进行进一步的数据分析，如主成分分析（PCA ) ，所以胶分析程序包所得的数据必须能转换成 Excel 数据表，并与统计软件包兼容。
3.6 酶解前胶块脱色 （参照 [ 14 ])
3.6.1 对于考马斯和 Sypro Ruby 染色凝胶块
( 1 ) 在水中浸置 15 min，弃去水，继续在 50 : 50 的水：乙腈中再浸置 15 min。
( 2 ) 重复上述清洗步骤。
( 3 ) 倒去所有液体，用乙腈覆盖胶块 5 min，此时胶块应该不透明并脱水。
( 4 ) 弃乙腈，加入 0.1 mol/L NH4CO3，使胶块再水化，放置 5 min。
( 5 ) 加入乙腈使乙腈：NH4CO3 比例为1 : 1，孵育 15 min。
( 6 ) 弃液体，抽真空离心使之干燥。
3.6.2 对于银染胶块
( 1 ) 将胶块放入“ Farmer’ s 还原剂” [20% (m/V) 硫代硫酸钠、1% (m/V) 铁氰化钾与水 1 : 1 : 1 混合 ] 直到胶块完全干净。用水冲洗。
( 2 ) 弃液体，抽真空离心使之干燥。
3.7 还原和烷化（参照 [ 14 ])
( 1 ) 胶块在 10 mmol/L DTT、0.1 mol/L NH4HCO3 中，56°C 浸置 45 min 使之泡胀。倒去多余液体，迅速换以 55 mmol/L 碘乙酰胺、0.1 mol/L NH4HCO3，室温，暗处孵育 30 min。
( 2 ) 弃去碘乙酰胺溶液，用 1 : 1 乙腈：0.1 mol/L NH4HCO3 清洗胶块 15 min。
( 3 ) 弃液体，抽真空离心使之干燥。
3.8 酶解
胰蛋白酶胶内消化（参照 [ 14 ]) :
( 1 ) 加入足量的胰蛋白酶溶液，刚好覆盖胶块，冰浴 45 min 使之泡胀。
( 2 ) 弃去多余液体，加人 25 mmol/L NH4HCO3/5 mmol/L CaCl2，刚好覆盖胶块。
( 3 ) 37℃ 温育过夜。
( 4 ) 肽段分离：快速离心收集消化物到底部，加入最小体积 25 mmol/L NH4HCO3，室温孵育 15 min。
( 5 ) 加入等体积乙腈，混匀，室温下孵育 15 min。
( 6 ) 收集上清，再用 5%（V/V）甲酸：乙腈（1 : 1 ) 重复抽提两次。
( 7 ) 合并上清，抽真空离心使之干燥。
3.9 利用 Zip Tips 为质谱分析进行多肽除盐和浓缩
3.9.1 MALDI - MS
( 1 ) 10 μl 0.1% (V/V) TFA 重悬消化物。
( 2 ) 10 μl 50: 50 乙腈：水润湿吸管尖，重复两次。
( 3 ) 10 μl 0.1% ( V/V) TFA 平衡管尖，重复两次。
( 4 ) 上下吸抽 10 次将样品吸入管尖（将多肽吸附到 tip ) 。
( 5 ) 0.1% TFA 清洗管尖。
( 6 ) 用 4 μl 50:50 乙腈：水，0.1% TFA 洗脱。
3.9.2 ESI-MS ( 参照 [ 15 ])
( 1 ) 10 μl 含 1% (V/V) 甲酸的 4%(V/V) 甲醇重悬消化物。
( 2 ) 10 μl 1% 甲酸润湿吸管尖，重复两次。
( 3 ) 上下移液 10 次进行蛋白质消化。
( 4 ) 用 10 μl 0.1% (V/V)甲酸清洗管尖。
( 5 ) 用 4 μl 含 1% ( V/V ) 甲酸的 70% (V/V) 甲醇洗脱。
3.10 MALDI 靶板点样
( 1 ) 1 μl 消化物与 1 μl 基质混合。
( 2 ) 点样于 MALDI 靶板，室温下风干。
