病毒包装技术——腺病毒载体的制备
1 菌液的准备
1.1. 取含目的质粒的甘油菌液（-80℃或-20℃冰箱中），待菌液融化后，在超净台用接种环划线于氨苄抗性的平板上，37℃倒置培养12-16h。待平板长出菌落，挑选生长状态良好的单克隆菌落。若无目的质粒的菌液，则需取库存质粒进行转化，然后挑单克隆摇菌。
1.2. 将单克隆接种于5ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min，震荡培养12-16h；
1.3. 将上述的5ml LB菌液分装到2个2ml离心管中5000g 离心8 min，弃上清（将离心管倒置于纸巾上数分钟，除尽上清），细菌沉淀待用。
2 腺病毒质粒的抽提（参考AxyPrep™ 质粒小抽试剂盒说明书）
2.1 取250ul 已加入RNase A 的Buffer S1 对细菌沉淀进行悬浮，将细菌沉淀吹打需均匀，不应留有小的菌块。
2.2 取250ul Buffer S2加入到上述菌悬液中，温和并充分地上下翻转6-8 次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
2.3 取250ul 4℃预冷的Buffer S3加入到上述溶液中，温和并充分地上下翻转10 次混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温放置5 min。
2.4 将上清转移到小抽制备管中，4℃ 5000g 离心1min，然后将小抽制备管从2 ml 离心管中取出，弃离心管中的滤液。
2.5 将制备管放置回离心管，加0.5 ml Buffer W1，5000g 离心1 min，弃滤液。
2.6 将制备管放置回离心管，加0.7ml Buffer W2，5000g 离心1 min，弃滤液；同样的方法，再用0.7ml Buffer W2 操作一次，弃滤液。
2.7 最后将小抽制备管置回2 ml 离心管中，12,000g 离心1 min，甩干酒精。
2.8 然后将小抽制备管取出，放置于洁净的1.5 ml 离心管中（试剂盒内提供），在小抽制备管的膜上均匀加60-80ul 的Eluent，室温静置1 min；然后12000g 离心1 min ，收集离心液，此为小抽质粒初液，-20℃保存。
2.9 取适量质粒初液进行质粒浓度测定，以备后续的质粒酶切线性化试验。
3 腺病毒质粒初液的酶切线性化
小抽质粒经PacI 线性化，体系如下：
10×NEB Buffer I | 10 ul |
质粒 | 10-20ug |
100×BSA | 2.0 ul |
Pac I（15 U/ul） | 1.0 ul |
加ddH2O至 | 200.0 ul |
37℃培养箱中酶切过夜（17-20h左右）。
4 线性化的腺病毒质粒纯化
4.1 将上述过夜酶切的产物短暂离心，转移至已灭菌的进口EP管内；然后加入200 ul（等体积）氯仿，上下颠倒混匀， 12000 rpm离心10min。
4.2 小心吸取上层液体至新的已灭菌的进口1.5mlEP管内，加入1/10体积（上清体积）NaAc(3M pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），上下颠倒混匀，此时会出现明显的絮状物即为DNA，-20℃中放置2-3h，13000 rpm离心15min。
4.3 弃上清，加入1ml 75%乙醇，手指轻弹EP管底部几次，重悬沉淀， 8000 rpm离心5min，弃上清；重复此步骤。
4.4 重复步骤3.4.3，浸泡沉淀10min，离心后取出离心管，将离心管带到细胞间生物安全柜内操作，尽可能弃上清液（最好调低压用泵吸，这样又快又干净，也可用10ul枪头吸残液，以免沉淀被吸走），在安全柜内开盖晾干酒精，沉淀由白色变透明即可。
4.5 加入10-20ul灭菌ddH2O溶解沉淀，4℃溶解过夜，轻弹/用枪吹打均匀后，取出0.5 ul加至含2ul ddH2O（5倍稀释）后电泳测定DNA浓度用于浓度的测定，其余质粒-20℃保存。
4.6 计算质粒浓度，做好记录和标记，-20℃保存。
腺病毒表达载体图谱：
