食品中蛋白质的测定
原理
向样品中加入浓硫酸和催化剂，充分混匀，然后加热消化分解，样中碳和氢被氧化成二氧化碳和水，其中的有机氮转化为硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
取样
由于食品种类繁多，形态及含氮量不一,因此取样应均匀，称样量应准确合理。对取样较困难的半固体(如冰淇淋)可置于已记重的纸片上称重(样品重=总重-纸片重) ,样品称好后,与纸片一起置于凯氏烧瓶底部。为减少系统误差可于空凯氏烧瓶中同时投入相同规格的纸片一张同时作空白。对于不同含氮量的食品，为保证终点滴定消耗酸的体积数在有效范围,取样量应视样品含氮量而定,-般含量在5 %~ 20 %的应精确称取(1.0~2.0)g(如糕点等) ；对含量在0.1 %~ 1.0 %的应相应增大取样量,以(5.0~ 10.0)g为宜(如淀粉等) ；对于高含量的(蛋白质大于30 %)的应减少取样量,以(0.2~1.0)g为宜(如大豆粉等)。
样品消化
浓硫酸具有脱水性和氧化性，可使有机物中的碳、氢被氧化为二氧化碳和水，蛋白质会分解为氨，然后氨与硫酸结合生成硫酸铵。通常加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点，一般情况下，纯硫酸的沸点在340 ℃左右，但是在添加硫酸钾后，可提高至400 ℃以上。提高温度使有机物加快分解。但是不能加入过多的硫酸钾，否则会因为温度过高，使生成的硫酸铵发生热分解成氨而造成损失。硫酸铜除作为催化剂外，还可以指示消化终点的到达，有机物全部消化完全后，溶液呈现清澈的蓝绿色，硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。
蒸馏
消化液中的硫酸铵在碱性环境下会转化成氨。为防止水中微量的氨气受热逸出，影响测定结果，所以水蒸气发生器中的水要保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐，需要足够的碱液使结合态的氨完全反应并释放出来，这个过程中的氢氧化钠一定要过量，过量的氢氧化钠会与硫酸铜生成蓝色的氢氧化铜沉淀，氢氧化铜受热分解成黑色的氧化铜沉淀。检验蒸馏是否完成，可用奈氏试纸法，NH4 或NH3遇奈氏试剂会反应生成棕红色的碘化汞铵化合物。
吸收
加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影响下一步滴定时指示剂的变色反应。温度过高会使硼酸吸收液对氨的吸收作用减弱，从而造成损失，故一般不超过40 ℃。
滴定
待吸收完全后，用硫酸或者盐酸标准溶液进行酸碱滴定，滴定液的浓度直接影响结果的准确性，必须按照要求进行配制和标定。混合指示剂在中性溶液中呈灰色，滴定终点时液体呈灰色。
注意事项
①所用的试剂溶液应用无氨蒸馏水配制；
②取样应具有代表性,取样前将样品充分混匀；
③样品称量放入凯氏烧瓶时，切勿使样品粘附在瓶颈部，避免样品未消化完全而造成氮损失；
④为了保证使烧瓶壁上的残渣消化完全，在消化过程中要不时地转动凯氏烧瓶；
⑤消化脂肪或糖含量较高的样品时，易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出，消化时应先消化加热并不断摇动，或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂；
⑥当样品消化液浑浊或未澄清透明时，可先将凯氏烧瓶放冷至室温后，再加入30%的过氧化氢，然后继续加热消化；
⑦加碱后，漏斗要进行水封，避免因装置漏气造成氨的逸出影响结果的准确性；
⑧要保证蒸馏装置不能漏气；
⑨在蒸馏时反应室与外界存在的压力差，蒸汽可将氨带出。故蒸馏时，要保证蒸汽均匀、充足，中间不能停止加热，防止发生倒吸；
⑩蒸馏前如果加碱后消化液呈蓝色而没有生成氢氧化铜沉淀，说明加入的碱量不足，需要适量补加碱；,蒸馏时为防止水蒸气发生器内液体爆沸，加入几片碎瓷片或大的玻璃珠，玻璃珠直径最好大于联通的玻璃管直径，以免玻璃珠进入玻璃管内影响蒸汽均匀、充足的输出； -冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，防止氨逸出，蒸馏完毕后先将冷凝管下端提离液面，再蒸1 min后清洗管口，再移开吸收瓶，最后关掉热源，否则可能发生倒吸。
凯氏定氮法误差分析
氮含量与蛋白质含量的折算
蛋白质主要由氨基酸构成，不同种类氨基酸的氮含量不同，因此计算含氮量和蛋白质含量时需根据实际情况选取适当的折算系数，否则会带来很大的误差。例如，一-些小分子的氨基酸、碱性氨基酸、氨基酸酰胺等氮元素的含量高于平均水平，如果待测样品中这类的氨基酸含量较高，为测量的准确性需要调整折算系数，否则会导致计算结果比真实的含氮量高。在标准中给出测最时计算的表达式如式(1) :
使用公式要根据待测样品的种类选取合适的F值，具体取值情况如下: 一般食物F=6.25； 纯乳与纯乳制品F=6.38；面粉F=5.70；玉米、高粱F=6.24；花生F=5.46；大米F= 5.95；大豆及其粗加工制品F=5.71；大豆蛋白制品F=6.25；肉与肉制品F= 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦F=5.83；芝麻、向日葵F=5.30；复合配方食品F=6.25。
多次测量取平均值减小偶然误差
整个测量中涉及大量试剂的配制使用，操作与读数，各种环境因素的干扰等，这些都会使测量中产生偶然误差，因此在蛋白质含量的测量中，最终测量结果需要进行多次重复性试验，并将得到的结果取算数平均值表示，以此减小测量的偶然误差，并且如果待测样品蛋白质的含量即:X≥1 g/100 g，其结果需要保留三位
有效数字:如果待测样品蛋白质的含量即: X<1 g/100 g,其结果只需要保留两位有效数字即可。
其他含氮物质的干扰
通过凯氏定氮法的基本原理与操作步骤可发现，使用该方法检测时，第一步消化的本质是将样品中的氮元素全部转化生成硫酸铵，即凯氏定氮法测量的是被测样品中有机物中含有氮元素的总量，因此该办法并无法消除样品中其他有机物中含有的氮元素对测量结果的影响，如尿素、三聚氰胺等。当年三鹿公司使用的蛋白质检测方法便为凯氏定氮法，最终未能检测出原料中的三聚氰胺而导致食品安全事件。除去样品中非蛋白质部分有机物中氮元素对整个测量的影响，要先去除非蛋白质中的氮元素再进行具体测量，或用其他方法测出非蛋白质中的氮含量，再用总氮含量减去该值再进行折算。
