蛋白质-DNA相互作用的甲基化和尿嘧啶干扰分析法—尿喀啶
| 实验方法原理 | 在尿嘧啶干扰实验中，探针是在TTP和dUTP混合物存在下用PCR扩增而产生，因此产物中的胸腺嘧啶残基被脱氧尿嘧啶取代（羟基取代了胸腺嘧啶的5- 甲基)。尿嘧啶碱基可被尿嘧啶-N-葡萄糖基化酶特异性切割，产生对哌啶敏感的脱嘧啶位点。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | 针对结合位点两侧的互补DNA链上特异序列的寡核苷酸引物2 mmol L 4种dNTP混合液0.5 mmol L dUTPTaq聚合酶缓冲液Taq聚合酶TE缓冲液 pH 7. 5〜8.0尿嘧啶-N-糖基化酶1 mol L哌啶（从10 mol L哌啶储液稀释）终止 加样染液 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1）用T4噬菌体多核苷酸激酶进行32P标记寡核苷酸引物的5'端设计用来进行PCR扩增的引物，使其包含蛋白质结合位点旁侧的序列，并位于两条互补链上。 2) 设立2个平行的含有以下试剂的50μL PCR反应： 5μL含有结合位点的DNA片段（0.2 pmol) 5μL 32P标记的寡核苷酸引物（20 pmol) 5μL另一条寡核苷酸引物（非标记，20 pmol) 5μL 2 mmol/L 4种dNTP 混合液 5μL 0.5 mmol/L dUTP 5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液 19μL H2O 1μL Taq DNA 聚合酶（5 U) 在优化的PCR扩增条件下做8个循环。 3) 用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物，然后进行酚抽提及乙醇沉淀。 4) 在闪烁计数仪上测量DNA沉淀的切伦科夫计数，计算其c/min值。沉淀重悬于TE 缓冲液至约20 000 cpm/μL。 5) 用1O5 cpm的探针在50μL反应体积中进行DNA结合反应，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合反应液。 6) 将胶进行放射自显影（1〜12h)，切出对应于蛋白质-DNA复合物和非结合探针的电泳带，并将其中的DNA纯化出来。将各DNA样品重悬于25μL TE缓冲液中。 7) 建立如下尿嘧啶-N-糖基化酶反应（50μL终体积）： 19μL H2O 5μL 1O× Tag DNA聚合酶缓冲液 25μL DNA (来自步骤6) 1μL尿嘧啶-N-糖基化酶（1 U)，37℃温育60 min。用乙醇沉淀终止反应。 8) DNA沉淀重悬于100μL 1 mol/L哌啶，90〜95℃水浴30 min。在管子上加上一玻璃 板以防盖子被冲开。哌啶切割之后，将管置于干冰上。 9) 在盖子上用大注射器针头扎孔，在真空蒸发器（如Speedvac)中冻干1 h或直至干燥。加100μL蒸馏水，再次冷冻和冻干。重复加水，冷冻和冻干。样品进行切伦科夫计数。 10) 往沉淀中加入终止/加样染液。95℃加热5 min,迅速置于冰上冷却。将非结合探针及蛋白质-DNA结合物加于6%或8%的测序胶上进行电泳及放射自显影。 |
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