GST融合蛋白的亲和纯化实验
GST 共结合纯化法
| 实验方法原理 |
琼脂糖颗粒和诱饵蛋白复合体在洗涤时并不会损失而且所有反应都含有等量的诱饵蛋白。为了证明在洗涤期间没有任何材料损失，应使用 1/10 的 GST 融合体加样做平行 SDS-PAGE 凝胶电泳并染色以便更确切地比较 GST 融合体蛋白带。另外，融合蛋白的降解可能导致诱饵蛋白的量减少，尤其是当使用粗提物（见图 19.2.1）而不是纯化标记的实验蛋白时。在对结合实验蛋白进行定量时必须将降解量计算在内。 |
|---|---|
| 实验材料 | E.coli 提取物（溶于琼脂糖颗粒结合缓冲液） [35S] Met 标记蛋白质 GST 融合蛋白（GST 和与琼脂糖颗粒结合） |
| 试剂、试剂盒 | 1 × SDS 样品缓冲液 凝胶固定液（10% 冰醋酸／45% 甲醇） |
| 仪器、耗材 | 离心机和 Beckman TLA-100转子 微量离心机 4℃ X射线胶片／储存磷光子屏 扫描光密度仪／磷光子显像仪 |
| 实验步骤 |
1. E.coli 可溶性蛋白抽提物放置在冰上解冻。 2. 每个反应取 500μl 解冻的 E.coli 提取物于 4℃，175000 g (使用 Beckman TLA-100 转子为 70000r/min）离心 30 min。 3. 转移上清液（不小于 400 μl）到 2 个试管中，每管 200 μl，并冰浴保存。 4. 在一支含 200 μl 步骤 3 获得的上清液试管中加入 1~5 μl [35S] 甲硫氨酸标记的实验蛋白，冰浴 15 min。 5. 4℃ 以最大速度微量离心 15 min，从体外转录混合物中除去不溶性蛋白质聚合体。将 200μl 上清液（含标记实验蛋白和提取物）转移到一个洁净的试管中。 6. 在另外一支含 200 μl 步骤 3 获得的上清液加入 20 μl 与琼脂糖颗粒结合的 GST 或 GST 融合蛋白（诱饵蛋白）并充分混匀。 每个反应需要 2~5 μg GST 诱饵蛋白融合体。在每个反应中最好加入约 20 μl 琼脂糖颗粒以便在 洗涤时可见到琼脂糖颗粒的沉淀。然而，如果 20 μl 琼脂糖颗粒结合的蛋白质超过 2~5 μg，即可补加未结合谷胱甘肽的琼脂糖颗粒提供必要的体积。 7. 将 200 μl 混匀的琼脂糖颗粒提取物悬液（步骤 6）加到含实验蛋白提取物（步骤 5）中。缓慢摇动于 4℃ 孵育 1~2 h。 8. 4℃ 以最大速度微量离心反应物 1 min，沉淀琼脂糖颗粒。移去上清液，琼脂糖颗粒沉淀用 1 ml 琼脂糖颗粒结合缓冲液洗涤，共洗 3 次。每次洗涤之后于 4℃ 以最大速度微量离心 1 min。最后一次洗漆后应小心移去所有液体。 除去所有液体以确保在分析性 SDS-PAGE 凝胶上所加的样品量相等。可用拧成条的薄型滤纸或带很薄尖头的 SDS 加样吸头除去最后遗留的几微升液体。 9. 在每支试管中直接加入 25 μl 1×SDS 样品缓冲液并置沸水浴 5 min。做分析性 SDS-PAGE 凝胶电泳。 所需样品量依据不同的诱饵蛋白/靶蛋白对和检测方式而不同。加入全部样品可避免加样体积的问题，因为这样就不存在所加样品与未加样品间比率不确定的因素了。 10. 可选：用考马斯亮蓝染色。 11. 在凝胶固定液中于室温将凝胶固定 30 min，缓慢振荡。干胶并做放射自显影或将它置于一个储存磷光子的屏幕上。使用扫描光密度计或磷光子显像仪对 X 射线片进行定性分析。
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