蛋白质印迹法的操作步骤
试剂准备
1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。
2、匀浆缓冲液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。
3、转膜缓冲液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液:考马斯亮蓝 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。
6、显色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H202 1.0μl。
样品制备
1、单层贴壁细胞总蛋白的提取:
(1)倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
(2)每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
(3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)
(4)每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
(5)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中(整个操作尽量在冰上进行)。
(6)于4℃下12000rpm离心5min(提前开离心机预冷)。
(7)将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于-20℃保存。
2、组织中总蛋白的提取:
(1)将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
(2)加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。
(3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。
(4)裂解30 min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
3、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取:
由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:
(1)将培养液倒至15ml离心管中,于2500rpm离心5min。
(2)弃上清,加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
(3)用枪洗干上清后,加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
(4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
含量测定
1、制作标准曲线
(1 )从-20℃取出1mg/ml BSA,室温融化后,备用。
(2) 取18个1.5ml离心管,3个一组,分别标记为0μg,2.5μg,5.0μg,10.0μg,20.0μg,40.0μg。
(3 )按下表在各管中加入各种试剂。
(4)混匀后,室温放置2min。在生物分光光度计(Bio-Photometer,Eppentoff)上比色分析。
2、检测样品蛋白含量
(1)取足量的1.5ml离心管,每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
(2 )取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100ul,混匀放置2分钟可做为空白样品,将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
(3 )弃空白样品,用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL),再用无菌水洗一次。
(4) 取一管考马斯亮蓝加95ul 0.15mol/L NaCl溶液和5ul待测蛋白样品,混匀后静置2min,倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意:每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次,无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测,这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5ul样品含的蛋白量。
