寡核苷酸探针在溶液中的杂交实验
试剂、试剂盒 寡核苷酸杂交液寡核苷酸预杂交液SSC 或 SSPETEAC1 洗涤液TMAC1或 TEAClTMAC1 洗涤液核酸和寡核苷酸放射性标记的寡核苷酸探针
仪器、耗材 杂交装置振荡培养器
实验步骤
材料
溶液和缓冲液
稀释贮存液至适当浓度。
寡核苷酸杂交液
6XSSC(或 6XSSPE)
0.05mol/L 磷酸钠（pH6.8)
1 mmol/LEDTA（pH8.0)
5XDenhardt’s 液
100ug/ml 变性、断裂的鲑精 DNA(Pharmacia 公司或按第 6 章的方案 10 所述制备)
100 mg/ml 硫酸右族糖酐（见箄 16 章信息栏 DEAE-右旋糖酐）
寡核苷酸预杂交液
6XSSC(或 6XSSPE)
0.05mol/L 磷酸钠（pH6.8)
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5XDenhandt’s 溶液
100ug/ml 变性、断裂的鲑精 DNA(Pharmacia 公司或按第 6 章的方案 10 所述制备)
6xSSC 或 SSPE
在本方案步骤 4、5 之前，将此液放置于冰上。
TEAC1 洗涤液
2.4mol/LTEACl
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
0.2 mmol/LEDTA(pH7.6)
1 mg/mlSDS
该洗涤液用于长度为 50~200 个核苷酸的探针。使用前须预温至所需溫度（见步骤 6、7)。
TMAC1(5mol/L) 或 TEACl(3mol/L)
配制 5mol/LTMAC1 或 3mol/LTEAC1 水溶液。TMACl 用于长度为 14~50 个核苷酸的探针，而 TEACl 则用于长度为 50~200 个核苷酸的探针。这二种试剂均可从 Aldrih 公司购买。在 TMAC1 和 TEAC1 溶液中，加入终浓度约为 10% 的活性炭，度摔 20~30 分钟。活性炭沉阵下来后，用 Whatman1 号通纸过滤季铵盐溶液，并用硝酸纤维素滤膜（0.45um 孔径) 过滤除菌。测量溶液的折光指数，用下列公式精确计算季铵盐溶液浓度：C=（n-1.331）/0.018, 式中 C 是季铵盐溶液摩尔浓度，n 是折光指数。过滤的溶液可在室温下保存于棕色瓶中。
TMAC1 洗涤液
3.0mol/LTMAC1
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
0.2 mmol/LEDTA(pH7.6)
1 mg/mlSDS
该洗涤液用于长度为 14-50 个核苷酸探针使用，使用前须预温到所需温度（见步骤 6、7）。
核酸和寡核苷酸
固定于硝酸纤维素、尼龙滤膜或其他滤膜的目的靶核酸（Southern 或 Norths 印迹、裂解的细菌克隆成噬菌体噬斑的滤膜）
探针
放射性标记的寡核苷酸探针
按方案 2 或方案 7 所述制备探针。我们推荐使用磷酸化探针，杂交前按方案 4 所述用 CPB 沉淀法纯化探针。这种纯化方法可以除去未掺入的 [γ-32P]ATP, 从而减少放射性自显影时易与阳性杂文信号混淆的强放射性斑点（胡椒粉斑点）的数量。
专用设备
杂交装置（请见步骤 1)
振荡培养器、水浴或杂交装置预温至 37°C(步骤 1 和步骤 3)，洗涤时调至适当的洗涤温度（步骤 7)。
方法
1. 滤器或膜在寡核苷酸预杂交液中 37°C 下预杂交 4~16 h。
圆形滤膜的预杂交、杂交与洗涤最好在 Sears Seal-A-Meal 袋或带有密封盖的塑科盒中进行，Southern 与 Northern 杂交膜可在有密封盖的玻璃管中进行。
2. 去预杂交液，置换成含 180pmol/L 的放射性标记的寡核苷酸探针的杂交液。
当数种寡核苷酸同时杂交时，每一种探针的浓度都应在 180pmol/L, 放射性标记探针的比活度应在 5X105 至 1.5X106cpm/pmol 之间。
3. 滤膜在 37°C 下温育反应 12~16 h。
4. 将放射性的杂交液弃至适当的容器内，在 4°C 下用预冷的 6XSSC 或 6XSSPE 洗涤滤膜三次，以洗去大部分硫酸右旋糖酐。
5. 在 4°C 下用预冷的 6XSSC 或 6XSSPE 洗涤滤膜两次，共 30 min。
6. 在 37°C 下用 TMAC1 或 TEAC1 液洗涤滤膜二次。
此步骤的目的是用季铵盐溶液置换 SSC 或 SSPE, 只有认真操作方可见季铵盐溶液的优越性。
7. 在低于图 10-2 指示的 Tm 值 2~4°C 的温度下，用 TMAC1 或 TEAC1 洗涤液洗涤滤膜二次，每次 20 min。
杂交体在含 TEAC1 的缓冲液中的 Tm 值比在含 TMACl 的缓冲液中低 33°C 确保缓冲液中预温至所需溫度，且温度波动小于±1°C。
8. 从洗涤液中取出滤膜，室温下吸干液体，按附录 9 所述进行放射自显影。
