液体活检在临床肿瘤诊疗的应用和医学检验实践（一）
液体活检(liquid biopsy)在肿瘤临床诊断治疗领域的应用日益广泛，是实现对肿瘤"个体化精准医疗"的重要手段。为科学规范液体活检技术在临床检验中的应用，中华医学会检验医学分会、国家卫生健康委员会临床检验中心共同制定了《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识》，并广泛征求了临床肿瘤专家和医学检验专家的意见。
本应用建议最后经中华医学会检验医学分会和国家卫生健康委员会临床检验中心组织专家进行讨论修改后，由中华医学会检验医学分会、国家卫生健康委员会临床检验中心共同发布。鉴于液体活检技术发展迅速，本应用建议将适时修订，以适应医学发展和满足临床应用的需求。
液体活检是指利用人体体液作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术[1,2]。相比于传统侵入式组织活检，液体活检具有依从性佳、标本易获取、特异性好等优势；更重要的是，其能有效克服肿瘤异质性，可有效实现精准的肿瘤辅助诊断、实时监测、疗效评价及预后判断[2]。因此，液体活检有望成为癌症早期辅助诊断、伴随诊断、治疗监测及预后评估的理想技术。液体活检主要包括循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)和外泌体等检测，其中ctDNA与CTC是目前最受关注的两类液体活检靶标[3,4]。ctDNA是指人体血液循环中携带有肿瘤特异性基因突变、缺失、插入、重排、拷贝数变异及甲基化等信息的DNA片段，其主要来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或者肿瘤细胞分泌的外泌体[5]。CTC是指自发或被动地从实体肿瘤病灶脱落进入到血液循环的肿瘤细胞。作为肿瘤转移/复发的"种子"，CTC携带有大量与肿瘤发生、发展、转移以及耐药相关的信息[6,7]。
在临床实践过程中应该谨慎评估液体活检的分析有效性、临床有效性以及临床实用性[8]。本专家共识围绕CTC和ctDNA两种靶标，综合近年来发表的液体活检领域重要研究成果、结合我国肿瘤液体活检的临床实践需求，就相关的临床常用检测技术的实施和质量管理提供常规指导原则。本共识主要分为两大部分：(1)液体活检的临床应用，(2)液体活检的医学检验实践。
第一部分 液体活检的临床应用
一、液体活检技术的选择
(一)ctDNA检测技术的选择
目前，实验室常用的ctDNA检测技术包括扩增受阻突变体系(amplification refractorymutation system，ARMS)、二代测序(next－generation sequencing，NGS)、数字PCR(digital PCR，dPCR)和核酸质谱检测等。ARMS方法是目前获得中国食品药品监督管理局(China Food and DrugAdministration，CFDA)批准可用于临床ctDNA检测的方法，在临床实践中应用相对普及。由于NGS方法在技术与成本方面存在瓶颈，使得ARMS在检测诸如EGFR等已知突变中具有明显优势。针对未知突变的发掘，NGS方法则具有其他方法无可比拟的技术优势。包括Nature Medicine[8]、Lancet Oncology[9]及New England Journal of Medicine[10]在内诸多顶级期刊所报道的多项临床试验结果证实NGS在耐药监测中具有重要的临床价值：通过NGS监测可有效发掘耐药新突变，及时调整干预措施，切实提高靶向治疗疗效。dPCR和基于质谱的核酸检测方法尽管可应用于已知突变ctDNA的检测，但仅限于实验室自建，尚缺乏高等级循证医学证据的支持，目前仍难以进入临床实践。基于上述研究结果与临床实际，专家组认为检测已知、单个靶向治疗敏感或耐药型突变时，建议使用ARMS方法；检测已知、多个平行临床治疗靶点或发现未知基因、探索临床价值与相关机制时建议使用NGS方法；dPCR具有验证NGS检测结果的潜能，但在应用前应当严格评估其检测性能与临床意义。
(二)CTC检测技术
CellSearch平台是目前唯一被CFDA批准用于定性检测循环血中上皮来源肿瘤细胞的技术。其在判断转移性结直肠癌、乳腺癌及前列腺癌患者预后的临床应用价值具有高等级循证医学证据支持。但此检测技术存在漏检率较高、富集后CTC活性差难以进行后续基因组分析等缺点。其他检测技术如免疫磁珠法和微孔过滤法等，尽管在多方面展现出优良的CTC检测性能，但目前仍缺乏足够的循证医学证据支持其临床应用。故临床常规检测CTC，建议各实验室选择适合自身条件的检测技术，在充分评估其检测性能后，应用于日常工作
临床实践中选择液体活检技术：
共识1 检测患者ctDNA是否含有已知的、单个靶向治疗敏感或耐药型突变时，建议使用ARMS方法。
共识2 检测患者ctDNA已知的部分或全部临床药物治疗靶点谱或耐药指示靶点谱，或发现患者基因未知突变、探索临床价值与相关机制时建议使用NGS方法。
共识3 临床常规检测CTC，建议各实验室选择适合自身条件的检测技术，在充分评估其检测性能后，应用于日常工作。
二、液体活检的应用范围
(一)肿瘤早期辅助诊断
1．ctDNA早期辅助诊断价值：
随着检测技术敏感度提高，目前ctDNA已可在早期肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌以及肺癌患者循环中被检出[11,12,13]，提示ctDNA对于这几种恶性肿瘤具有早期辅助诊断潜能。必须注意的是，特定突变例如P53突变可在健康人群中被检出[14]；此外，可用于早期诊断辅助ctDNA分子谱在不同癌种变异度较大且都未经过大样本临床验证，实际效能仍不明确[15]。因此，需要探索更加特异的ctDNA分子谱并设计大规模前瞻性临床试验证实其价值，目前距离真正临床应用还有较大距离。
2．CTC早期辅助诊断价值：
既往CTC研究多集中于其转移/复发的预测价值[16,17,18]。近年来研究证实CTC的释放是一种肿瘤早期事件，提示CTC对肿瘤早期辅助诊断具有重要价值[19,20,21]。然而非肿瘤患者例如炎症性肠炎或慢性肝炎患者体中可检出低水平的假阳性结果[21,22]。由此可见，目前CTC并非一种完美的早期辅助诊断靶标。此外，目前也缺乏CTC展现出优于影像学诊断的临床证据。综上，现阶段CTC仍不适合单独用于肿瘤早期辅助诊断，需要更多的循证医学证据证明其价值。
(二)指导临床用药
1．ctDNA的临床用药指导作用：
肿瘤精准治疗可通过检测肿瘤相应的基因信息，选择合适的靶向药物用于后续治疗。故ctDNA检测可提供十分重要的参考信息。截止2018年3月，主要肿瘤相关基因改变的靶向药物选择如表1所示。
表1 肿瘤相关基因改变与靶向药物选择
需要注意的是，目前ctDNA检测仅在非小细胞肺癌中被美国食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批准用于指导EGFR酪氨酸激酶抑制剂选择并写入美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南。对于其他药物选择，目前仍处于探索阶段，尤其在检测T790M时，对阴性结果应尽可能通过后续的组织检测进行确认。因此，未来还需要更多前瞻性循证医学证据来支撑ctDNA的指导作用。
2．CTC的临床用药指导作用：
CTC作为完整细胞，具有多种来源的肿瘤信息，包括蛋白、DNA突变、编码及非编码RNA信息等[18]。针对CTC的体外培养与药敏实验被证明可用于筛选靶向药物，具有巨大的临床转化潜能[4,34]。但是，现有临床CTC检测体系在活性CTC分离问题上仍存在关键性的技术瓶颈，尚不能满足提供多元化信息以指导靶向用药的临床需求；其他CTC分离检测技术或指导价值不明确或短时间内难以转化。故尽管CTC检测对于指导临床实行精准治疗具有重要的潜在价值，但在更先进的技术和更可靠的临床证据出现之前，不鼓励在实际临床工作中用其指导靶向化疗。
(三)靶向药物伴随诊断
1．ctDNA在靶向药物伴随诊断中的应用：
靶向药物使用过程中实行伴随诊断有助于确保药物安全性与有效性，是执行"精准医疗"理念的核心步骤之一。因此，伴随诊断在临床肿瘤综合管理中的价值愈发显著。截至2018年4月，已有多种靶向药物伴随诊断系统被FDA批准用于实际临床工作，常见适用伴随诊断的药物及其靶点如表2所示。
表2 常见适用伴随诊断的药物及其靶点
ctDNA检测相对于常规组织活检具有非侵入性、患者依从性好、异质性低、可反复取材等优势，其在靶向药物伴随诊断中具有很大的优势[1]。目前，ctDNA检测应用于非小细胞肺癌EGFR靶向治疗伴随诊断已被NCCN写入指南。未来伴随着更先进技术以及更多临床证据的出现，将会有越来越多ctDNA检测用于靶向药物伴随诊断。
2．CTC在靶向药物伴随诊断中的应用：
目前并无循证医学证据提示CTC可应用于伴随诊断，但小规模研究显示CTC分子谱分析对于靶向药物伴随诊断具有积极意义[35]。未来需要更多的高级别临床证据充分探索CTC在伴随诊断中的作用。
(四)实时疗效监测
1．ctDNA实时疗效监测价值：
相比传统的影像学与血清蛋白类肿瘤标志物，ctDNA在反映疗效方面具有更好的特异性与敏感度，理论上可准确反映机体肿瘤负荷的细微变化[1]。已有小规模队列研究证实连续监测肿瘤患者体内ctDNA突变丰度的变化可反映治疗后个体肿瘤负荷变化，及时提示临床更换有效的治疗策略[6,18,36]。但是，目前ctDNA检测存在重复性不佳、不同实验室间检测结果一致性较差、检测结果在不同实验室间互换性低、缺乏量化DNA负荷的最佳单位等缺陷，严重制约了ctDNA在临床实践中的应用价值[37]。因此，检测ctDNA反映实时肿瘤疗效仍处于临床前阶段，亟待技术进步与大规模RCT研究来充分验证其价值。
2．CTC实时疗效监测价值：
CTC在反映疗效中的优势在于其信息的多维性，除数量变化外还可提供丰富的参数供临床分析，从而系统地描绘出肿瘤演进分子图谱。研究显示CTC动态变化与疗效显著相关，且较影像学与蛋白类标志物展现出更好的敏感度与特异性[7,38]。但是，在现有检测技术条件下其疗效评估效能略逊于ctDNA，且CTC检测存在诸如重复性较差、循环空间异质性、缺乏理想分离方案等缺陷，限制其大规模临床应用[17]。因此，CTC暂时不是一种可直接应用于临床疗效监测的理想靶标，其转化有待更好的检测技术出现与更多的临床证据证实。
(五)肿瘤进展与不良预后早期预警
1．ctDNA早期预警作用：
ctDNA检测对于包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌在内的多种实体瘤进展具有重要预警价值，其丰度改变可早于影像学发现复发/转移灶[1]。这意味着可通过ctDNA检测筛选出复发/进展高风险的患者，为其在临床进展前创造干预治疗的机会。此外，ctDNA丰度也与肿瘤患者无病生存期(disease free survival，DFS)以及总体生存期(overall survival，OS)密切相关，特定亚克隆ctDNA的检出对预测患者预后具有重要预测价值[37]。但是，目前大部分报道为小样本研究，缺乏大样本、多中心、前瞻性设计的临床试验；此外亦缺乏高级别循证医学证据支持患者能够从ctDNA指导的临床决策中获得比常规肿瘤管理更多的临床收益[8,36,37]。因此，临床转化ctDNA用于肿瘤进展与不良预后早期预警仍需要更多的高级别循证医学证据。
2．CTC早期预警作用：
CTC检测被FDA审批可用于预警转移性结直肠癌、转移性乳腺癌、转移性前列腺癌患者的疾病进展/不良预后[18]。对其他实体恶性肿瘤例如恶性黑色素瘤、肝癌、胃癌等，CTC也展现出良好的预测价值[39]。但是，目前仍缺乏足够的循证医学证据支持CTC检测在其他恶性肿瘤中的早期预警价值。未来需要更多设计良好的临床试验来证实CTC在肿瘤进展/不良预后早期预警中的价值。
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