液体活检在临床肿瘤诊疗的应用和医学检验实践（二）
(六)耐药机制探索
1．ctDNA在耐药机制探索中的应用：
ctDNA在反映靶向治疗获得性耐药中具有天然优势，通过高灵敏度方法追踪ctDNA变异情况，进而绘制肿瘤获得性耐药基因变化演进图谱有助于揭示耐药新机制，发现新的治疗靶点[40,41]；在发现特定亚克隆与耐药关联性的基础上，深入分析耐药克隆亚群并探究其分子机制，可为逆转获得性耐药提供充分的转化依据[42]。因此，ctDNA是一种非常理想的耐药机制探索切入点。需要注意的是，目前此领域的研究正处于起步阶段，还不足以引入临床实践。
2．CTC在耐药机制探索中的应用：
CTC本身作为肿瘤转移/复发的"种子"，其展现出的干细胞样特征、上皮－间充质转化特征、以及极强的耐受能力都提示其是肿瘤演进过程中耐受治疗的生力军与基石[43]。已有研究证实通过分析CTC基因谱可揭示化疗耐受的具体机制，并藉此逆转耐药[44]。但是目前此领域研究仍局限于极小部分的患者，对肿瘤的异质性与复杂性考虑并不充分，广泛性仍有待验证。
液体活检应用范围：
共识4 推荐液体活检应用于无法获取组织标本的患者。
共识5 ctDNA检测可应用于指导肺癌EGFR靶向药物选择与伴随诊断，ctDNA可能用于疗效监测、早期辅助诊断及肿瘤进展与不良预后早期预警，但现阶段仅限于科研探索。
共识6 CTC检测可用于转移性结直肠癌、乳腺癌与前列腺癌的进展/不良预后早期预警，但其指导用药、疗效监测、靶向药物伴随诊断及早期辅助诊断作用现阶段仅限于科研探索。
第二部分 液体活检的医学检验实践
一、实验室的总体要求
(一)实验室环境要求
液体活检实验室对于场地的空间、环境(温度、湿度、电压、水质)和分区有严格要求。建议根据开展项目预留出仪器和辅助设备的装载空间，以及操作和数据处理的工作空间。仪器不可直接安装于空调下方和阳光直射处，四周应留出适当空间便于日常操作、定期维护保养和检修。实验室温湿度等环境因素应严格参照厂商建议的最适工作条件设定，以保证仪器正常运行。为保证仪器检测性能的稳定和可靠，建议配备稳压的连续不间断电源。实验室应根据实际用途，制定适宜的水质标准，定期质检。
涉及核酸检测的实验室，各工作区空气及人员流向需严格参照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》配置，工作中有严格避免污染的措施：(1)前处理和建库时，建议避免低浓度标本与高浓度标本分开，如胸腔积液、腹腔积液标本与血液、脑脊液和尿液标本分开，避免标本间的交叉污染；(2)扩增前后的操作步骤分开，避免扩增产物污染非扩增区；(3)影响检测结果的特异处理步骤应独立分区。样品制备区及其他分区需要时应配备通风柜或超净台，实验室应配置固定和移动紫外线灯，波长为254 nm，照射时离实验台的高度一般为60～90 cm。
涉及细胞培养时，操作人员必须更换、穿戴好工作服、鞋、帽和口罩方能进行实验。有关细胞培养的操作均在超净台上完成，严格按无菌程序操作，所有进入细胞培养室的人员都必须遵守实验室有关的规章制度。
(二)实验室安全要求
依据《中华人民共和国卫生行业标准－临床实验室安全准则》、《中华人民共和国国家标准实验室生物安全通用要求》和《危险化学品安全管理条例》等相关文件，实验室应制定适当的安全防护措施。实验室需安装安全冲淋设施和洗眼器。实验过程中使用的化学危险品应贴有成分标签，按说明要求分类储存、双人双锁。依据《医疗卫生机构医疗废弃物管理办法》，结合实际情况，对实验过程中产生的固体、液体危险废弃物的收集、存放和处理原则。建议实验室责任人定期组织实施安全评估。
(三)人员要求和资质
实验室管理者应监督液体活检项目的顺利实施和开展，为临床提供精准的个体化医疗服务，并确保实验室设备设施的完善、分区环境和生物安全符合相关法规和条例，同时指导实验室人员的规范化流程培训和教育。
建议开展液体活检项目的实验室根据需求配备具有临床检验、临床肿瘤学、遗传学、分子生物学、及生物信息分析学科背景的多类跨学科的人员。实验操作人员需熟练掌握分子生物学理论与技术、经技术相关的理论和操作实践培训，通过技能考核，获得上岗资质后才能正式上岗，在岗期间仍需定期培训和考核。特殊技术人员(如CTC形态学观察人员等)在岗期间除定期个人培训和考核，还需完成人员间比对考核。初学人员建议在有经验人员的指导下完成操作。生物信息分析人员应兼具生物信息学、分子生物学和(或)临床医学专业背景。报告签发需由获得中级及以上职称，具备分子生物学、遗传学和临床医学等多种专业背景，从事肿瘤液体活检相关工作2年及以上，经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人(高级职称或医学博士学位)执行。
(四)规范化文件
1．实验室必须根据实验室的质量管理体系与法规要求撰写规范化文件。实验室规范化文件如表3所示。
表3 实验室规范文件列表
2．液体活检实验方法的执行：实验室主任需要确保液体活检实验方法在开展前完成检测性能确立与临床应用评估、建立完善的质量控制体系、编写从标本采集到结果解释全过程的规范化操作规程并且签字许可新的液体活检实验方法认证报告以及执行。
二、体液标本选择、采集和预处理
(一)体液标本选择一般规律
在临床实践过程中，应综合考虑到患者病灶累及部位、转移情况的复杂性、不同体液标本的特征，优先选择液体活检靶标最易检出部位标本(例如广泛腹腔/盆腔转移患者可优选腹水；中枢转移性肿瘤可优选脑脊液)；针对难以判断的患者，建议联合多种体液标本的检测结果，为临床勾勒肿瘤演化的全貌，提供多维的肿瘤患者诊疗的图谱。体液标本选择一般规律如表4所示：
表4 体液标本选择一般规律
液体活检实验室建立要求：
共识7 临床液体活检实验室必须遵循相关法规，有严格避免污染的措施并且定期核查评估。
共识8 建议开展液体活检项目的实验室根据需求配备多类跨学科人员。
共识9 报告的审核和发布须由从事液体活检相关工作2年及以上、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人(高级职称或医学博士学位)执行。
(二)标本的采集和预处理
体液中存在较强的背景干扰，加之液体活检的信息源极其微量，易在分析过程中出现偏差，因此液体活检对分析全过程的要求相对较高，尤其在标本预处理步骤需避免背景细胞或核酸ctDNA和CTC的稀释作用，同时进一步防止对CTC的破坏和对ctDNA片段化以及降解，导致最终假阴性结果。
1．体液ctDNA：
临床实验室能实现多种不同体液标本内ctDNA的检测，本应用建议仅概述常见体液标本处理的基本原则，对于其他体液标本的处理建议参考权威文献或抽提试剂盒的说明。
(1)血浆：目前研究表明最佳的标本类型为血浆，且最好采用含细胞稳定剂的抗凝管或者EDTA抗凝管采集血液。常规采集流程如下：肘部采集静脉血10 ml(采血量视具体情况而定，建议不少于10 ml，避免因标本量不足导致假阴性结果)，避免凝血、溶血及空腹状态。若选择EDTA－K2抗凝采血管，采血后轻柔颠倒8～10次，采集完毕即刻送至检测实验室，建议冰浴送检，防止白细胞裂解。建议2 h内进行两步离心完成血浆分离，分离后的血浆可直接进行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提；若选择Streck采血管(特殊抗凝剂和保护剂)，采血后轻柔颠倒8～10次，采集完毕无需即刻送至检测实验室(可室温保存3～5 d)，常温转运保存即可。建议在7 d内进行两步离心完成血浆分离，分离后的血浆可直接进行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。两步离心法：在低温(4 ℃)条件下，先以1 900×g转速将标本离心10 min，吸取上清，再以16 000×g转速离心10 min，最终获得无细胞的血浆标本。
(2)胸腔积液、腹腔积液：临床医师通过胸膜腔或腹腔穿刺术，采集胸腔积液或腹腔积液20 ml置于预添加EDTA抗凝剂的无菌容器中(采集量视具体情况而定)，采集完毕应即刻送至检测实验室，常温保存。建议2 h内完成两步离心分离上清(同血浆分离步骤)，分离后的上清可直接进行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。
(3)尿液：留取随机中段尿20 ml置于无菌容器(采集量视具体情况而定)，采集完毕应即刻送至检测实验室，常温保存。建议2 h内完成两步离心分离上清(同血浆分离步骤)，分离后的上清可直接进行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。
(4)脑脊液：临床医生通过腰椎穿刺术，采集脑脊液2～5 ml置于无菌容器(采集量视具体情况而定)，采集完毕应即刻送至检测实验室，常温保存。建议2 h内完成两步离心分离上清(同血浆分离步骤)，分离后的上清可直接进行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。
(5)唾液：患者在标本采集前1 h内应禁食、禁饮、禁烟以及禁止口腔清理程序。采集早晨9～10点的唾液标本置于无菌容器，采集完毕应即刻送至检测实验室，常温保存。建议2 h内完成低温2 600×g离心15 min并分离上清，分离后的上清可直接进行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。
2．外周血CTC：
肘部采集静脉血10 ml(采血量视具体情况而定，建议不少于10 ml，避免因标本量不足导致假阴性结果)，避免凝血或溶血。采血完毕应即刻送至检测实验室，常温保存。若选择EDTA－K2抗凝采血管，建议24 h内完成检测；若选择专用细胞保存采血管，建议72 h内完成检测。
三、液体活检技术的优化和验证
在正式应用于临床前，应对检测技术或实施流程逐步优化，并完成相关性能验证或确认。各实验室在进行性能验证时，可结合自身特点与检测项目需求，在本章节设定框架下制定合适的性能验证流程。若优化实施要素，建议对检测技术或实施流程进行再验证或确认，以保证优化后的性能符合检验和临床要求。再验证或确认的程度和范围视优化的要素和程度而定。验证或确认必须贯穿整个实验流程。
体液标本选择、采集和预处理：
共识10 体液标本选择时应综合考虑肿瘤来源、肿瘤部位、播散途径、以及不同体液标本的特征，综合考虑以期提高检验效率。
共识11 标本预处理应遵循快速、稳定的原则，针对不同标本采用不同方案进行处理，尽可能保证待测物质的稳定性和浓度，确保检测质量。
(一)基于PCR方法(包括ARMS和dPCR)ctDNA检测体系的性能验证
分析性能验证项目应包括特异性、敏感度、测定下限、重复性、准确性、抗干扰能力六项。验证具体内容应遵循CLSI相关文件指示，具体参考如表5所示。
表5 ARMS定性检测方法性能验证参考文件
(二)基于NGS方法ctDNA检测体系的性能确认
NGS方法性能确认须包含阳性预期值(Positive Predictive Value, PPV)、阳性百分比一致性、重复性、可报告范围/参考范围、最低检出限、抗干扰性能、临床有效性、及生信分析流程确认。确认具体内容应遵循CAP相关共识文献指示，具体参考如表6所示。
表6 NGS检测方法性能验证参考文献
对已完成性能确认的检测体系进行改进或改动时，仅需依据体系改变部分作出相应验证即可，无需重新进行完整系统验证。
(三) CTC检测体系的性能验证
CTC检测体系应依据相应EP文件对其精密度、正确度、可报告范围、参考范围进行性能验证，具体参考如表7所示。
表7 CTC检测体系性能验证参考文件
液体活检技术优化和验证：
共识12 商品化ARMS方法的检测体系应当遵循相关EP文件验证其敏感度、特异性、测定下限、重复性、准确性、以及抗干扰能力。
共识13 基于NGS方法检测体系须行阳性预期值、阳性百分比一致性、重复性、可报告范围/参考范围、最低检出限、抗干扰性能、临床有效性、及生信分析流程确认；如对已完成性能确认的检测体系进行改进，仅需依据体系改变部分作出相应验证即可，无需重新进行系统验证。
共识14 CTC检测体系应当遵循相关EP文件验证其精密度、准确度、可报告范围、参考区间；如基于其他方法的CTC检测体系则须在前述基础上再行检出限、干扰及携带污染验证。
四、质量管理
实验室质量管理体系分为质量保证和质量控制，需贯穿液体活检的整个实施流程，即从分析前、分析中到分析后。完善的质量管理和控制用于确保检测系统稳定性和结果可靠性，有效避免误差，为临床肿瘤诊疗提供更为准确的证据。
(一)质控品的选择
质控品选择在质量管理中具有关键性作用。应按照定性或定量的实验目的选择合适的质控品，以期达到理想的质量管理质量。质控品选择标准如表8所示。
表8 液体活检质控品选择标准
(二)分析前质量管理
关注患者状态，标本采集时的患者状态将影响检测结果，如基础状态、治疗方案、肿瘤转移情况，因此选择适当的采集时间点极为重要。确保患者在标本采集前两周前未进行化疗或放疗，以避免假阴性的结果；对存在严重炎症的肿瘤患者，建议在白细胞恢复正常水平后再行检测，以避免假阴性结果；推荐早晨空腹采取静脉血，以防止油脂影响DNA提取和检测。标本采集、运输和预处理：严格按照液体活检标准操作程序(standardoperating procedure, SOP)实施，如有疑问请及时与临床联系和反馈。避免标本存在溶血、凝块和脂血等情况，以保证后续检测结果的准确和可靠。
(三)分析中质量管理
抽提模板质控：凡下游涉及PCR或测序等方法，建议采用多种方法对模板核酸的质量进行评估，包括纯度、浓度和完整性，以确保满足检测平台的最低要求。
1．室内质控：
为监测分析过程中的每个步骤，要求质控品与标本的操作步骤基本相一致。建议优选商品化的质控品，若缺乏商品化产品，实验室可尝试自建。质控品的选择和构建首先需注意与临床患者标本的模拟度，同时保证组份稳定且均一，数量充足，便于长时间分析：(1)质控品配制：建议由经验丰富的专业人员在专门区域进行构建、配制和分装，切勿在临床标本操作区域。自建质控品要求采用高灵敏的检测方法进行评价；(2)质控要求：对于定性检测项目，建议运行弱阳性、阴性质控品以及空白对照；对于定量检测项目，建议运行定值、阴性质控品以及空白对照。考虑到每个检测平台的实际成本和临床可操作性，实验室可自行规定质控频率和质控覆盖位点；(3)质控规则：无论是商品化或自建质控品，实验室需建立质控的可接受标准。定量检测项目建议使用质控图和设定的质控规则。
2．质间质评：
(1)室间质量评价(extemal quality assessment, EQA)：通过参加国内外相关的EQA评价实验室检测能力，分析和总结能力比对的结果，关注评价结果的趋势或改变；(2)其他评价方式：对于无室间质量评价计划的检测项目，建议与外部实验室相同或相近的方法比对。
3．NGS检测平台的重要参数：
(1)文库质量：构建的文库在上机测序前需进行质量分析，应设定每个检测项目的文库质量要求，明确接受或拒绝的标准；(2)测序芯片：测序时根据检测标本量和质量要求选择合适的芯片，以保证测序质量和靶区覆盖深度；(3)生物信息分析质量指标：单碱基质量、碱基质量中位数、重复reads百分比、包含接头序列的reads数量、回贴reads百分比、目标区域reads百分比、目标区域的平均深度、目标区域测序均一度。
(四)分析后质量管理
分析后质量管理涉及多方面因素，需联合生物信息学、分子生物学、遗传学和临床医学专业背景的多人合作完成报告签发和临床解释。
液体活检质量管理：
共识15质量管理体系构建应严格参照CNAS－CL36：2012文件的要求设定相应质量控制程序并验证，以达到预期的结果质量。
共识16 质控品应按实际需求综合考量，选择最合适的质控品。
共识17 质控管理实施应贯穿检测整个过程(分析前、分析中、分析后)。
五、数据分析与检测报告注释
(一)液体活检报告注释
依据检测靶标和技术的不同，液体活检的报告内容也有所差异，但原则上检测报告一般应体现以下内容：(1)检测名称，如xx肿瘤xx基因变异检测报告；xx肿瘤CTC检测报告等；(2)患者基本信息：姓名、性别、年龄、住院号、送检科室及医生等；(3)标本基本信息：标本类型(血浆、胸腹水、脑脊液、尿液等)、标本性状(是否存在凝块、溶血、脂血等)、采样时间、收样时间、送检日期和报告日期；(4)病理诊断信息：肿瘤组织类型、TNM分期等；(5)检测方法和平台以及其重要的参数说明；(6)检测结果和cut－off值(基于检测技术的性能或临床建议)；(7)临床意义解读：临床意义解读应客观平实地描述，对于疾病相关性只描述既往研究中的疗效或预测，不能出现使用何种治疗手段或策略的语言，同时报告中应附上相关的权威指南、参考文献、专业数据库和分析工具网址；(8)备注：若检测项目、方法、平台和结果等存在局限性，建议在报告中明确指出，避免不必要的诊疗误差；(9)若检测失败，应阐述检测失败的原因；(10)最终报告应由报告检测者、制定审核者和报告签发人联合审定签发。
(二)检测报告解读
液体活检的报告解读建议实验室人员和临床医生共同完成，报告解释应综合考虑：(1)患者基本状态：标本采集前的治疗情况、标本采集与治疗时间间隔、是否存在严重炎症等；(2)疾病基本状态：分子病理结果、肿瘤组织类型和分期、进展情况等；(3)检测方法和平台的特征，包括检测敏感度和特异性以及检测过程中的影响因素等；(4)检测结果评判标准，如非典型肿瘤细胞和循环肿瘤微栓的判断和报告；数字PCR检测过程中阳性液滴的设门和空白限的设定；生物信息分析过程中对特殊标本测序数据的过滤和软件参数的调整。
数据分析与检测报告注释：
共识18 检测报告中除了患者与标本基本信息外，还应纳入检测体系信息与临床意义。
共识19 液体活检的报告解读建议实验室人员和临床医生共同完成，报告解释应综合考虑多方面信息。
展 望
液体活检技术正以前所未有的速度向前发展。随着分子生物学技术的不断革新，液体活检检测的灵敏度与特异性也不断提高，使其成为未来对抗肿瘤的一大"利器"。未来液体活检发展将集中于三个方面：(1)新临床应用拓展，例如CTC体外培养联合药敏筛选个体化治疗药物、获得的CTC进一步用于各种方法(如ARMS、FISH、NGS等)检测肿瘤基因突变、ctDNA克隆进化分析揭示化疗获得性耐药机制、以及液体活检技术指导生物免疫治疗；(2)新的检测靶标发掘，外泌体、血小板以及循环非编码RNA已经展现出巨大临床应用潜能，有待更加深入系统的研究证实其价值；(3)新检测技术开发与转化应用，包括单细胞测序、质谱技术、微流控芯片及多普勒光谱等尖端技术正逐步走出基础研究实验室，进入临床实验室，依赖这些技术将切实提高液体活检的质量。
我们应从检验医学的角度出发，立足于"准确性"与"临床有效性"这两个关键点，对液体活检项目的检验性能与临床意义进行系统评估，为指导临床精准诊疗提供充分的理论基础与转化依据。我们需要不断总结经验，不断提高认识，进一步加强规范，提高检测质量，积极推进液体活检的发展，助力肿瘤精准诊疗。
