OmegaSE血液DNA提取技术
实验概要
OmegaSE血液DNA提取试剂盒说明书(E.Z.N.A. SE Blood DNA Kit)。
主要试剂
1. 用dd H2O稀释ERLBuffer(10×)。
2. 用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存。
D3471-00：加入27 ml dd H2O D3471-00：加入8ml无水乙醇
D3471-01：加入225 ml dd H2O D3471-01：每瓶加入80ml无水乙醇
D3471-02：加入630 ml dd H2O D3471-02：每瓶加入80ml无水乙醇
3. 可选：蛋白酶K ( 20 mg / ml )。
主要设备
1. 台式离心机(微量离心机至少13，000 xg；15 ml台式离心机转子能力须达到2，000 xg)；
2. 无核酸酶2 ml、1.5 ml离心管；
3. 水浴锅：65℃；
4. 培养箱：37℃。
实验步骤
1. S E血液DNA提取试剂盒操作步骤(不多于300 ul全血)
1) 将样品加至2 ml离心管，加3倍体积ERLBuffer，混匀，室温放置5 min，放置时适当摇匀。(注意：ERLBuffer必须稀释后才能用)
2) 室温14， 000 xg离心30 s，在不打散白色沉淀的情况下去除上清，剩余10 ul左右。如果血液样品是冰冻的，重复操作步骤1 - 2直至沉淀为白色。(如果白细胞沉淀上仍有一些红细胞或细胞残质，可加2体积的E R L混匀，室温放置2 min，进行步骤2至沉淀为白细胞沉淀。
3) 振荡离心管重悬白细胞沉淀，加入240 ul WTLbuffer，高速振荡30 s裂解细胞，溶液变得粘稠，如果溶液混匀后仍有明显凝块存在可放在37℃水浴直至其消失。
4) (建议)加3 u l蛋白酶K，混匀，放于55℃水浴10-30 min。
5) 加入2ul Rnase A溶液混匀，室温放置10 min。
6) 加入250 ul Buffer Bl，振荡混匀，65℃10 min，在此期间混匀2次。
7) 加250 ul无水乙醇，振荡完全混匀。如果出现可见颗粒，上下摇晃10次。
8) 把HiBind DNA柱套在2 ml收集管中(已提供)，将第七步得到的溶液全部转入柱中，大于8，000 xg离心1 min，弃去滤液
9) 把柱子装在新收集管中，加入500 ul HBuffer，按上述条件离心，弃去滤液。
10) 把柱子装回收集管中，加入650 ul DNA Wash Buffer (含乙醇)，按上述条件离心，弃去滤液。
注意：浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。
11) 把柱子装在新收集管中，加650 ul DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。
12) 弃去滤液，把柱子装回收集管，最高速(大于13，000 xg )离心空柱2 min以干燥柱子基质。
注意：不要忽略此步――这对从柱子上除去乙醇至关重要。
13) 把柱子装在干净的1.5 ml离心管上，加入50-100 ul 70℃预热的Elution Buffer到柱子中央。室温静置5 min。
1 4) 室温下，10，000 xg离心1 min以洗脱DNA。
1 5) (可选)将柱子置于另一干净的1.5 ml离心管上，重复步骤13)-14)以洗脱残留在柱子上的DNA。
2. SE血液DNA提取试剂盒操作步骤( 400 ul -1 ml全血)
1) 将少于1 ml样品加至15 ml离心管，加3倍体积1×ERLBuffer，混匀，室温放置5 min ，放置时适当摇匀。(注意：ERLBuffer必须稀释后才能用)
2) 室温2，000 xg离心5 min，在不打散白色沉淀的情况下去除上清，剩余20 ul左右。如果血液样品是冰冻的，重复操作步骤1)-2)直至沉淀为白色。(如果白细胞沉淀上仍有一些红细胞或细胞残质，可加2体积的ERLBuffer混匀，室温放置2 min，进行步骤2)至沉淀为白细胞沉淀。
3) 振荡离心管重悬白细胞沉淀，加入230 ul WTLbuffer，高速振荡30 s裂解细胞，溶液变得粘稠，如果溶液混匀后仍有明显凝块存在可放在37℃水浴直至其消失。
4) (建议)加3 ul蛋白酶K，混匀，放于55℃水浴30 min。
5) 加入2 ul Rnase A溶液混匀，室温放置10 min。
6) 加入250 ul BufferBl，振荡混匀，65℃放置10 min，在此期间混匀2次。
7) 加250 ul无水乙醇，振荡完全混匀。如果出现可见颗粒，上下摇晃10次。
8) 重复1方案步骤8)-15)。
