基于纳米粒子等离子体共振耦合的细胞中分子组...（一）
Dynamic Imaging of Molecular Assemblies in Live Cells Based on Nanoparticle Plasmon Resonance Coupling
基于纳米粒子等离子体共振耦合的细胞中分子组装的动态影像
Jesse Aaron, Kort Travis, Nathan Harrison, and Konstantin Sokolov
Department
of Biomedical Engineering, Department of Physics, UniVersity of Texas
at Austin, Austin, Texas 78712, and Department of Imaging Physics, UT MD
Anderson Cancer Center, Houston, Texas 77030
Received June 8, 2009; Revised Manuscript Received July 21, 2009
ABSTRACT 摘要
We used molecular-specific gold nanoparticles to monitor epidermal growth factor receptors (EGFR) in live A431 cells over time. Dark-field hyperspectral imaging, electron microscopy, and electrodynamic modeling were used to correlate optical properties of EGFR-bound plasmonic nanoparticles with receptor regulation state. We showed that receptor trafficking resulted in a progressive red shift of greater than 100 nm in the nanoparticle plasmon resonance wavelength over a time period of 60 min. Furthermore, we demonstrated that changes in peak scattering wavelengths of gold nanoparticles from 546±15 to 574± 20, and to 597±44 nm are associated with EGFR trafficking from the cell membrane, to early endosomes, and to late endosomes/multivesicular bodies, respectively. Finally, we used the changes in scattering spectra of EGFR -bound nanoparticles and a straightforward statistical analysis of RGB-channel color images of labeled cells to create near real-time maps of EGFR regulatory states in living cells.
在A431活细胞中我们用含有特定的金纳米粒子的分子去监控表皮生长因子受体(EGFR)。用暗场高光谱成像、电子显微、电动模拟等手段将已绑定了等离振子纳米颗粒的EGFR的光学属性与受体的调控状态联系起来。在纳米粒子等离振子共振超过60分钟的条件下，我们显示了受体的运输导致了大于100纳米的红移。再者,我们证实，金纳米粒子巅峰散射波长的变化(从546±15到574±20，到597±44 nm)与EGFR的运输有关（分别从细胞膜到早期胞内体，到晚期胞内体/多泡体）。最后, 利用绑定纳米粒子的EGFR的散射光谱的变化以及标定细胞的三基色图像的一个直观数据分析，我们制作了活细胞中接近实时的EGFR调控状态的图像。
生物学关键的任务就是探测和监测细胞中大数量的生物分子间的相互作用，因为这些相互作用在很大程度上控制着几乎所有细胞类型的行为。成像法是必不可少的测量完整细胞蛋白组装时空特性的方法。在本次工作中,我们将展开纳米粒子等离子体共振耦合(NPRC)的应用并展示一种新颖而又普遍的方法，利用这种方法我们可以在活细胞中以纳米级别的量度来描述细胞的装配，并为其成像。
在过去的几十年里,荧光共振能量转移技术(FRET)的应用使得许多研究人员能够在亚微观无损伤的条件下阐明细胞重要功能之间的联系1。近来,图像显微技术(ICM)及其变体已经被广泛地用来描述大蛋白分子在原位的装配及群集,包括EGFR。虽然所有的这些技术都是非常有用的，但是FRET技术只适用于探测不同类型的两个非常近的(?5 nm)单个分子1,4。多样的ICM技术可以在亚显微计量级别下用来测量众多分子的关系和群集，而FRET附加信息只是一种统计平均值，不直接揭示集群的分布大小或者说任何与形成群集的毫米级别的生物分子有关的附加信息。而且ICM技术对背景干扰是高度敏感的，图像系统的分辨率经常没有被充分利用。另外，FRET和ICM技术都被光漂白严重限制。在电子显微镜中这些限制因素都可以避免，特别是在纳米级别免疫金法为生物分子装配成像的条件下5。然而达到这种要求要付出一些代价，缺少了实时、活细胞性能，并需要繁冗的样品制备过程。鉴于上述所有原因，在活细胞中用高位立体瞬时分析方法去定量监视细胞群集时，就要求有新的物理解决方法来发展并补充现有可以利用的技术。
最近,等离子共振的纳米粒子已经被开发成特定的分子探针，用在高灵敏度探测6-16和细胞的光热破坏上17-20。相比观察单个纳米粒子，当两个等离振子纳米粒子间距非常近时，它们就会显示纳米粒子等离振子共振耦合效应(NPRC)，表现为在金属纳米粒子装配光学横截面上的一个光谱的漂移21,22。光谱漂移很大程度上取决于粒子间的距离，灵敏度可以通过改变粒子的大小来方便地调整。对中心间距小于3倍粒子半径的粒子群，NPRC是非常重要的，为上万计的纳米提供一个有效的可探测交互距离的范围。正是因为这个效应，用NPRC来演示一个有吸引力的FRET模拟，作为探测DNA-DNA,24-26 DNA-蛋白质,27 和 蛋白质-蛋白质的二态交互作用28的有效证明。这些研究显示NPRC不受光漂白的影响，而且相比FRET其扩展探测范围不在同一数量级上。
我们之前已经证明NPRC提供了一种强有力的癌症诊断方法,通过更便利的检测聚集在癌变组织中的生长因子6,29。现在,我们扩大了NPRC的适用范围，研究活细胞内分子的聚集和调节机制。我们已经开发了一种新型的计算框架来从NPRC光谱中获得信息，除此之外，用一个实用的图像分析方法来推断生长因子受体调节状态。
我们观察了表皮生长因子受体（EGFR）的交易机制，一个酪氨酸激酶（RTK）受体控制了一些最基本的细胞过程,包括DNA复制和细胞分裂30。在治疗手段中EGFR也是重要的肿瘤标志物,对开发新型癌症治疗法有深远的影响31,32。EGFR内在过程是一个关键的调节方式,决定了细胞的行为。众所周知,绑定EGFR的膜能引起配位基绑定促进信号的增长。然而,最近发现，即使在早期的胞内体EGFR内化之后信号可以继续发放，最终在溶酶体进入后才停止31。 涉及EGFR的再循环和细胞核的转移过程都增加了EGFR的复杂性30,33。因此问题的关键就明显了，有效的EGFR不仅涉及蛋白质的检测,也包括细胞局部区域内的组织、聚合与分离的纳米级别细节。在本研究中,我们证实NPRC是一个方便的方法,有利于检索暗场条件下贴有EGFR特定金纳米粒活细胞的颜色图像信息。
特定金纳米粒子分子的合成
近球形的金纳米粒子(平均直径25nm)使用了Frens描述的方法来合成，用柠檬酸钠的化学方法减少氯金酸34。通过改变Au3 +与柠檬酸盐的比率、可以控制产生纳米粒子的大小。此次工作中的粒子的大小，拟定金胶质的粒子聚集浓度大约为每毫升6×1011颗粒。
