使用Agilent Femto Pulse系统对用于生物样本库样品...（一）
使用Agilent Femto Pulse系统对用于生物样本库样品的基因组DNA进行质量评估
作者
Chava Pocernich，Jolita Uthe，Steve Siembieda
摘要
核酸样品的质量保证和质量控制对于生物样本库和进行基因组相关操作的实验室以及多种分子生物学应用必不可少。革命性的 Agilent Femto Pulse 系统是唯一一款能够替代脉冲场凝胶电泳分析高分子量 (HMW) gDNA 的仪器。Femto Pulse 系统为研究人员提供了极高的灵敏度和快速的分离时间，能够在 70 分钟内对单个细胞量的 gDNA 进行定量和鉴定。安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒设计用于分离 HMW gDNA，可实现可重现的分子量测定、定量分析和基于基因组质量值 (GQN) 的质量控制评估。
前言
DNA 完整性的表征对于生物样本库质量控制评估至关重要。了解基因组 DNA (gDNA) 质量是 DNA 完整性的独特价值， 并对下游过程的成功必不可少。随着人们对长读长和全基因组测序技术、比较基因组杂交以及使用 linked reads 的序列组装技术的兴趣日益增加，了解 gDNA 质量、片段化、分子量分布和浓度成为了成功获得结果的必要条件。
通过确定样品的片段化和降解程度，部分评估 gDNA 质量。影响样品质量的几个因素有：样品储存、提取方法、反复冻融和变性[1]。在提取和处理 gDNA 期间，DNA 可以在许多不同位点发生物理、酶促和化学剪切，变为小片段。物理剪切发生在长时间的剧烈混合条件下，以及反复冻融和冰晶形成期间。DNA 周围细胞环境的破坏将通过自由基氧化、脱嘌呤和 gDNA 的核酸酶降解引发酶促和化学剪切，导致一系列短片段的生成。在使用高强度化学品提取 DNA 时也可能发生化学剪切。用大口径移液枪头缓慢混合可以防止 gDNA 物理剪切，而通过冷冻、脱水或添加螯合剂（如 EDTA）可避免化学和酶促剪切过程。考虑到 DNA 完整性会以多种方式发生改变，建议在长期储存 gDNA 样品之前记录核酸质量。
通常用过夜脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 分析分子量超过 50 kb 的 gDNA。配备安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Agilent Femto Pulse 系统是市场上唯一能够替代 PFGE 评估高分子量 (HMW) gDNA 的解决方案。分离过程在短短 70 分钟内完成，节省了确定样品质量所需的时间和金钱[2]。此外，安捷伦设计的 ProSize 数据分析软件可以通过基因组质量值轻松分析 gDNA 质量。用户可针对其特定应用设定合适的分子量阈值。然后，ProSize 根据高于分子量阈值的样品总测量浓度分数计算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等级对样品进行评分，0 表示样品均未超过分子量阈值，10 表示 100% 的样品高于分子量阈值。
实验部分
在配备基因组 DNA 165 kb 试剂盒 (FP- 1002-0275) 的两台不同 Femto Pulse 系统上分离 40 号（gDNA 样品 1）和 92 号（gDNA 样品 2）Coriell 样品，以证明仪器间一致性以及随时间推移的降解程度。在配备安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上对来自 PacBio 的剪切 gDNA 进行分离，以展示 GQN 指标的灵活性。在配备基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上对 Promega 人 gDNA (#G1521) 进行分离，以显示峰大小和特征片段长度。
结果与讨论
分子量测定
Femto Pulse 系统利用脉冲场方法分离高分子量
gDNA，用于确定大于 50 kb 的 gDNA 的平均分子量。此外，电泳图提供了直观的样品分子量分布图。在不使用脉冲场方法的情况下，大于约
50 kb 的样品显示为尖峰且测定分子量超过 60 kb。在配备基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上分析
gDNA 样品 1，弥散条带平均分子量为 44800 bp，分布在 1200 到 300000 bp 之间（图 1）。
仪器间的一致性
在配备安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上分析两种不同的 gDNA 样品。在两台不同的 Femto
Pulse 仪器上对几种浓度下的两个样品进行了分析，以证明较大浓度范围内不同仪器之间的分子量测定、浓度定量和 gDNA
质量分析的可靠性与一致性（图 2）。每台仪器各稀释比例的分子量测定和定量分析精度（误差）分别低于 8% 和
16%，均处于试剂盒的规格范围内。此外，GQN 证明仪器有极高精度，CV 为 3%。
