采用Agilent Femto Pulse系统对不同基因组DNA提取进...（一）
采用Agilent Femto Pulse系统对不同基因组DNA提取进行质量评估
作者
Chava Pocernich，Jolita Uthe，Steve Siembieda 安捷伦科技有限公司
摘要
Agilent Femto Pulse 系统采用革命性设计，是唯一一款能够自动进行高分子量 (HMW) gDNA 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 分析的仪器。与传统 PFGE 分析相比，Femto Pulse 系统能够在更短时间内对 gDNA 分子量和完整性进行定性分析。应用领域涵盖三代测序或长读长测序平台的小基因组分析到复杂基因组从头组装，这些应用要求 HMW gDNA 样品满足高质量标准。有多种方法针对特定的下游应用从选取的真核和原核来源样品中分离 gDNA。而分离 gDNA 的分子量和质量会受到不同提取方法的影响，因此需要对 gDNA 样品进行可靠的质量评估。安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒专为 Femto Pulse 系统上的 HMW gDNA 分离而设计，可提供准确而重现的分子量和质量评估。利用基因组 DNA 165 kb 分析试剂盒在 Femto Pulse 系统上对比五种不同gDNA 提取方法得到的gDNA 分子量和质量。
前言
大片段基因组文库（如用于10X Genomics、Oxford Nanopore 和 PacBio Technologies 的文库）需要起始基因组 DNA (gDNA) 满足特定质量条件才能成功获得结果。影响样品质量的几个因素包括：提取方法、样品储存、反复冻融循环和变性[1]。在提取和处理 gDNA 期间，DNA 可以在许多不同环节发生物理、酶促和化学剪切，变为小片段。因此，准确可靠的 gDNA 质量评估对于这些下游测序过程的成功至关重要。通过确定样品的片段化和降解程度，部分评估 gDNA 质量。过夜脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 通常用于评估高分子量 (HMW) gDNA 的完整性。配备基因组DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统是市面上唯一一款用自动分离系统替代 PFGE 的解决方案，可在短短 70 分钟内评估 HMW gDNA。
实验部分
将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 菌株 BY4741（ Dharmacon，部件号YSC1048）在 YPD 肉汤培养基（赛默飞世尔科技公司，部件号 A1374501）中培养 24 小时。离心收集细胞，再按照若干种方案提取 gDNA。方法 A 采用经典的苯酚-氯仿-异戊醇 (25:24:1)（赛默飞世尔科技公司，部件号 AC327111000）提取方案[2]，方法 B、C、D、E 根据以下四种不同市售试剂盒的制造商说明书进行：
Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒（Promega Life Sciences，部件号 A1120）、Quick- DNA 通用试剂盒（Zymo Research，部件号 D4068T）、MegaLong gDNA 试剂盒（G-Biosciences，部件号 786-146）、Genomic-tip 20/G 以及基因组 DNA 缓冲液组合（Qiagen，部件号 10223 和19060）。方法 B 是液相提取，方法 C 和 E 是离心柱提取，方法 D 是膜提取。分别通过 PFGE 以及在配备安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒（部件号 Fp-1002-0275） 的 Agilent Femto Pulse 系统（部件号FPv1-CE2）上采用 FP-1002-22 gDNA 165 kb 方法（快速法）或 FP-1002E22 扩展 gDNA 165 kb 法（扩展法），对提取的 gDNA 进行分离。在 Femto Pulse 系统操作软件中选择基因组 DNA 165 kb 快速和扩展法。将 50 ng/µL 左右 gDNA上样至 0.8% 琼脂糖凝胶（Lonza SeaKem Agarose，部件号 50152），并用 Pippin- Pulse 预设方案（ 5 至 150 kb）通过PFGE 分离 18 小时 (Sage Sciences)。使用 Agilent FP 165 kb 分子量标准品（165、50、42、23、21、17.7、10 kb）（部件号 FP-7002-U035）和低范围 PFG 标准品（New England Biolabs，部件号N0350S）。分离后，用 Agilent FP 嵌入染料（部件号 FP-6001-U030）对琼脂糖凝胶进行后染色，并用紫外透照仪观察。
结果与讨论
在 Femto Pulse 系统上用快速和扩展基因组 DNA 165 kb 方法测定分子量分布
Femto Pulse 系统软件为基因组 DNA165 kb 试剂盒提供了两种分离方法。快速法是一种 70 分钟的脉冲场毛细管电泳 (CE)
分离，最适合对 80 kb 以下的 gDNA 样品进行分离与分子量测定。扩展法采用另一种持续 3.5 小时的脉冲场 CE
分离方法，专用于改善大于 80 kb 的 gDNA 样品的分离和分子量测定。用快速法分离的大于 80 kb 的基因组 DNA 峰形尖锐、紧凑，与
165 kb 左右 DNA 的片段峰形相似[3]。导致这一结果的部分原因为脉冲场分离期间用于样品分离的时间太短。扩展法在更长的分离时间中使用了脉冲场
CE 替代方法，并将相同 gDNA 样品分离为更宽的弥散条带，更能代表样品的整体分子量范围。扩展法推荐用于大于 80 kb 的 gDNA
样品（快速法仅能将其分离为 165 kb 左右的紧凑峰）。
Femto Pulse 系统使用基因组
DNA 165 kb扩展法来分离大于 80 kb 的提取 gDNA（图 1）。使用 Agilent ProSize 数据分析软件上的
Smear Analysis 选项卡分析 gDNA 的分子量分布。弥散条带分子量分布包含整个弥散条带范围内的浓度分布。酵母 gDNA
的弥散条带分子量分布和完整性随使用的提取方法不同而变化。使用提取方法 A、B、C、D、E 得到的基因组 DNA 样品的弥散条带分子量依次减小（表
1）。液相提取法 A 和 B 得到了分子量最大的完整 gDNA 弥散条带。用传统液体苯酚-氯仿提取法 (A) 提取的基因组 DNA 产生的完整
gDNA 较长，平均为163670 bp，而另一种液相提取方法 B 为103111 bp。方法 C 离心柱 gDNA 提取方法和方法 D 膜 gDNA 提取方法，在五种不同提取方法中表现出相似的弥散条带分子量分布结果。
