荧光原位杂交技术检测植物基因组中整合的转基...（一）
荧光原位杂交技术检测植物基因组中整合的转基因片段实验
实验材料 核苷酸
试剂、试剂盒 冰水8-羟基喹啉秋水仙素固定剂酶解缓冲液
仪器、耗材 载玻片玻璃盖玻片解剖针及镊子
实验步骤
原位杂交的基本操作方法（图 14 .2 ) 演化自 Southern 杂交：标底是玻片上的染色体和细胞核，探针是带标记的待测 DNA 序列 [ 本书中即是转基因和对照，图 14.3(a) ]。对探针和染色体分别或同时进行变性处理，以便产生杂交分子（图 14.2)。多数实验方案采取杂交过夜的方式，这对于低拷贝 FISH 非常重要。而对检测重复 DNA 序列，杂交时间有几小时就足够了。正如 Southern 杂交一样，需要经过数次的洗涤，目的是去除未结合的探针并鉴定杂交的紧密性，也就是鉴定探针和目的 DNA 序列的相似度，而这是在一个双链 DNA 螺旋中保持稳定杂交的必要条件。为了准备染色体，除了杂交温度、钠离子浓度和洗涤液等条件外，一种双螺旋去稳定剂如甲酰胺也可以调控杂交紧密度。在直接 FISH 技术中，染色体可以马上复染，常用 DAPI 复染；在使用荧光素和地髙辛标记的非直接性 FISH 中，需要使用免疫细胞化学的方法做检测。
染色体荧光染色 [ 图14.1 (a ) ] ，按照染色体固定和制备的操作，检测转基因的株系及个体的倍性水平（见 3.1 节和 3.2 节），然后进行复染、封片和分析等步骤（见 3.7 节和 3.8 节）。
1. 材料固定
制备含有大量干净而铺展的分裂中期染色体，是保证 FISH 和染色体染色成功的重要因素。用于固定和染色体制备的植物材料必须是健康、无病害并生长旺盛的。它可以是任何分生组织，但在转基因植株生长过程中，用什么材料做检测，则取决定于试验的时间，可以取幼苗的根尖、盆边缘老株上新长的根尖，或者水培植株的根尖。对某些物种来说，也可以选用嫩枝、叶片或新芽的分生组织细胞。
在多数情况下，获得最大数量的分裂中期的染色体对试验成功是很重要的。为了获得更多的处于分裂中期的细胞，常常需要对材料进行预处理，使染色体发生浓缩，并破坏纺锤体微管，以获得充分分散的染色体。纺锤体微管抑制剂，如秋水仙素 （ 广泛用于染色体计数）可以形成高度浓缩的染色体，另一些染色体浓缩剂，如冰水或者 8- 羟基喹啉，能产生更为伸展的染色体，以更适合于 FISH 分析。
( 1 ) 所有步骤均使用干净的镊子在干净的容器中进行。在收集和预处理阶段（步骤 2~4 ) ，避免将材料接触固定剂和化学药品（见注 11)。
( 2 ) 选择合适的植株材料以获得分裂期细胞。确认材料生长于适宜条件下。
( 3 ) 选择细胞分裂期阻滞剂加入试管中。
( 4 ) 将根 （1~2 cm 长）或者芽转移至 3~5 ml 的分裂期阻滞剂中（见注 12) ，试剂用量是材料的 5 倍，然后将盖子拧紧。
( 5 ) 培育。
( a ) 冰水： 24 h
( b ) 8-烃基喹啉：生长所需温度下放置 30~45 min , 然后 4℃、30~45 min。
( c ) 秋水仙素：室温 2~4 h 或者 4°C 、12~16 h 。
( 6 ) 将材料迅速吸干，放入新鲜固定剂中。为保迅速渗透，确保固定剂没有水分污染。除管子上用（油墨）毡笔做标记外，用铅笔在便签或小纸片上做好记号，然后将纸片一并放入固定剂中。
( 7 ) 室温放置 1 h，然后保存于 4°C 或者 -20℃（见注 13 ) 。
