血小板/T细胞活化抗原1
1985年Burns等以活化T细胞为免疫原制备了抗活化T细胞表面抗原的单克隆抗体，并将其中1株单克隆抗体Leo-A1识别的抗原命名为人T细胞系特异性活化抗原1（T lineage-specific activation antigen1, TLiSA1），实验证实TLiSA1参与了CTL细胞的活化与分化〔1-3〕。随后的实验发现TLiSA1也高表达于血小板表面，并与血小板的活化和凝集功能有关，遂将此抗原重新命名为血小板/T细胞活化抗原1（platelet and T cell activation antigen 1, PTA1）〔4〕。1997年我实验室与澳大利亚Newcastle大学癌症研究中心合作成功克隆了人PTA1 cDNA〔5〕。随后，我室又成功克隆了长臂猿和猴PTA1全长cDNA。PTA1基因的克隆为进一步深入探讨PTA1的功能打下了良好的基础。
有趣的是，PTA1的基因序列与1996年DNAX分子与细胞生物学研究院Shibuya等发表的DNAM-1分子（DNAX accessory molecular-1, DNAM-1）序列相同。DNAM-1分子的发现过程同PTA1十分相似，最初作者制备针对人CTL的单抗，发现其中DX11单抗能明显抑制CTL对多种肿瘤细胞系(如Colo205、PA-1、MCF7等)的杀伤作用。Shibuya等首先从外周血单个核细胞(PBMC)中通过DX11单抗亲和层析纯化了DX11识别的抗原，进行了部分蛋白序列测定，以多肽对应的PCR引物扩增出DNAM-1的部分片段，再以32 P标记的探针进行筛选，最终获得了DNAM-1的cDNA序列。Shibuya认为DNAM-1分子是一种新的粘附分子，并可能与信号转导有关〔6〕。
到目前为止，PTA1的配体（PTA1 ligand, PTA1L）尚未基因克隆成功。本实验室已成功构建、表达了PTA1胞膜外区/IgG1 Fc段融合蛋白，通过PTA1/Ig融合蛋白进行的免疫组化及粘附阻断实验证实PTA1配体表达于肿瘤细胞系Colo205细胞膜表面。PTA1配体的鉴定正在进行之中。
PTA1的基因及结构
1997年Sherrington等从以pCDM8为载体的活化Jurkat细胞cDNA文库中，通过Leo-A1单抗panning的方法筛选得到人PTA1阳性克隆〔5〕。人PTA1基因为单拷贝基因，定位于染色体18q22-q23。其cDNA全长1.4kb，5和3端分别有174bp和111bp非编码区。开放读框1 011bp，编码336个氨基酸，包括18个疏水氨基酸的信号肽，成熟蛋白由318个氨基酸组成，属I型跨膜糖蛋白。胞膜外区由232个氨基酸组成，形成2个免疫球蛋白超家族V样结构域，这种结构在免疫球蛋白超家族成员中是唯一的一个。PTA1分子第19和90位的保守半胱氨酸形成链内二硫键，第134和204位的保守半胱氨酸形成第二个链内二硫键，这2个二硫键分别起到稳定胞膜外区2个结构域的作用。在90位和204位半胱氨酸处均存在免疫球蛋白超家族V样结构域的特征性基序Asp-X（Gly或Ala）-X-Try-X-Cys基序。PTA1胞膜外区含有8个潜在的N-糖基化位点和3个潜在的O-糖基化位点。当用内切糖苷酶（Endo F）消化N-连接的糖基后，PTA1的相对分子质量减小了30×103，表明PTA1分子胞膜外区是高度糖基化的，这可能与PTA1参与分子识别有关。PTA1的糖基中含有大量的唾液酸，神经氨酸酶（neuraminidase）消化唾液酸后，其pI由3.5～4.2转变为7.8～8.2。PTA1穿膜区由25个疏水氨基酸组成。胞浆区有61个氨基酸，含有3个酪氨酸、6个丝氨酸和6个苏氨酸，胞浆区尾部含有一段EDIYVNY基序，中央酪氨酸的氨基端有2个带负电荷的谷氨酸和天冬氨酸（ED），羧基端为缬氨酸、天冬酰胺和酪氨酸（VNY），此基序可作为非受体型蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase, PTK）的底物。并可以和蛋白酪氨酸磷酸酶2（protein tyrosine phosphatase 2, PTP2）氨基端的SH2结构域结合。另外，在PTA1胞浆区还存在着酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase Ⅱ）和PKC作用的底物S/T结构。胞浆区的上述结构和基序提示PTA1分子可能参与T细胞和血小板活化的信号转导过程〔4，5〕。人、猿、猴PTA1分子cDNA及蛋白水平的同源性为93%～95%，表明PTA1在生物进化过程中高度保守并可能具有重要的功能。
Burns等通过Leo-A1单抗亲和层析的方法从血小板上纯化了PTA1分子，并进行了蛋白部分序列测定，证实PTA1分子为一全新的分子。通过纯化的PTA1分子再次免疫制备了抗PTA1的单克隆抗体NEWE1和NEWI1〔3〕。而后通过免疫沉淀证实从血小板、Jurkat细胞和T细胞上沉淀下来的分子是相同的。采用流式细胞仪检测发现Leo-A1和NEWE1能结合到PMA刺激的Jurkat细胞膜表面，并且平均荧光强度相同，但NEWI1不能在PMA刺激的Jurkat细胞膜表面着色，当增加Jurkat细胞膜通透性后，NEWI1能使Jurkat细胞着色，并且获得与Leo-A1和NEWE1相同的荧光强度，表明NEWI1识别的表位位于PTA1胞浆区。
用Leo-A1单抗进行的血小板裂解物免疫沉淀证实PTA1相对分子质量为(65～70)×103，蛋白带并不均一。O'Farrell双维电泳（two dimensional gel analysis）表明从活化T细胞免疫沉淀得到的PTA1分子为一弥散产物，pI范围为4.0～6.5，而血小板来源的PTA1分子的pI为3.5～4.2，其差别可能是由于糖基化不同造成的，用神经氨酸酶切除唾液酸后，两种来源的PTA1分子pI均转变为8.0，相对分子质量减少为(60～65)×103〔4〕。Burns等还发现，在不同的细胞系及不同的刺激条件下，通过免疫沉淀有2～3种相关蛋白同PTA1分子共沉淀下来，相对分子质量为(65～90)×103不等，pI4.0～6.5。当用Leo-A1单抗及不同血小板活化剂刺激血小板时，PTA1被快速磷酸化，同时相关蛋白中的部分分子也发生了低水平的磷酸化〔4，7〕。但这些共沉淀分子的特性、作用及结构仍不清楚。这些附加蛋白在人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒感染的HUT102B2细胞系中总能被免疫沉淀下来，在PHA刺激的T细胞中有时能沉淀下来，而在Jurkat细胞系中未能沉淀下这种蛋白。这些蛋白的发现总与肌动蛋白（actin）同时存在，提示这些蛋白定位于细胞内。
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