杆状病毒-昆虫细胞表达系统3
七、杆状病毒表达载体的新一代昆虫细胞宿主
最早的鳞翅类昆虫细胞的遗传转化技术出现在1990年（Jarvisetal.，1990)。那时，研发该技术的初衷在于构建一个稳定转化的昆虫细胞系，它旨在能够持续生产目标重组蛋白而无需使用杆状病毒进行感染。然而, 构建这个生产用细胞系所用的载体及方法也为构建具有新型特色的转基因昆虫细胞系提供了条件，这些新型细胞系将能够更好地支持重组杆状病毒介导的外源蛋白的生产。第一个进行宿主细胞改造的案例是要解决本章前面提出的一个问题, 即杆状病毒-昆虫细胞系统能够进行真核蛋白加工，但这种加工与更高等真核细胞对蛋白质的加工并不总是相同。对于这个局限，大家了解最多的一个例子是Sft和HighFHve细胞都能够对新合成蛋白质进行N-糖基化, 但其对JV连接的糖链(〗V-聚糖)[参考Harrison和Jarvis(2006;2007b),Shi和Jarvis(2007)的综述]的加工却达不到哺乳动物细胞那样的程度。第一个从改造细胞的角度来解决这个问题的方法是使用在AcMNPVid启动子调控下的牛/M，4-半乳糖基转移酶（bovine片1，4-galactosyltransferase)cDNA转化Sf9 细胞（Hollisteretal.，1998)。该cDNA编码Sf9 细胞中没有的N-聚糖加工酶，导人该酶的目的是使Sf9 细胞的内源蛋白加工能力得到扩充，这样转基因细胞系生产的iV■糖基化糖蛋白的JV-聚糖就可以经过进一步的加工，更接近于人源iV-聚糖。确实，最终得到的命名为S_GalT的细胞系具有该酶的编码序列，并能够组成型表达这个哺乳动物基因，这使它具有了亲代细胞系不具备的能力: 生产具有部分人源 N-聚糖结构的外源糖蛋白。但这仅仅是对细胞进行改造的第一步，因为需要对Sf9 细胞蛋白质N-糖基化途径进行进一步的人源化，而这需要「敲人」更多的其他哺乳动物功能基因。总的来说, 可以通过构建W启动子驱动下的编码其他功能的哺乳动物基因，然后用其生成另外的转基因 Sf9 细胞亚克隆来完成这个任务（Aumilleretal.，2003;HollisterandJarvis，2001;Hollisteretal.,2002;Seoetal.,2001)。所构建的每个细胞系都能够支持杆状病毒的复制和杆状病毒介导的外源基因表达，同时也能够组成型地表达所转入的哺乳动物基因。最终，每一个这种转基因的昆虫细胞系较其亲代Sf9 细胞具有更深入的N-聚糖加工能力，能够产生具有更接近人源JV-聚糖糖基的糖蛋白。HighFive细胞也有类似的转基因细胞系，它们转入了在id启动子控制下的两种不同的哺乳动物糖苷转移酶的基因（BreitbachandJarvis,2001)。Invkrogen已经将一个最初命名为SfSWT-I的源于 Sf9细胞的转基因昆虫细胞系商业化，其商业名为MIMIC, 该细胞系具有更深入的N-糖基化途径，在含有血清的培养基中生长时能够表达出人源化的重组糖蛋白。在不久的将来，具有很多哺乳动物基因的更髙级的昆虫细胞系会被商业化，这样的细胞系能够在不含血清的培养基中生产具有唾液酸化末端糖基的糖蛋白（Aumilleretal.>2003)。另有一种很有希望作为改进的杆状病毒表达载体宿主细胞的转基因鳞翅类昆虫细胞系衍生于 Sf9细胞，它转人了立即早期杆状病毒启动子控制下的多分DNA病毒 Wznbrin 基因(Fath-Goodinetal.,2006)。就像上面讨论的那样，杆状病毒介导的多分DNA病毒 mMyhn 基因的表达可以使杆状病毒感染的Sf9细胞活的更长，从而增加了在多角体蛋白启动子控制下的共表达的外源蛋白的产量。同样的道理，一个经过工程改造能够组成型表达基因的转基因Sft 细胞系具有更长的寿命，感染携带黄色荧光蛋白基因的重组杆状病毒后能够以更高水平表达黄色荧光蛋白（Fath-Goodinetal.,2006)。ParaTechs公司已经将 3种不同的衍生于 vankyrin-enhanced(VE)Sf9的细胞系进行了商品化。
目前已经有了 MIMIC 和 VE 细胞系, 将来会出现别的同样类型的转基因昆虫细胞系，它们的出现能够允许研究人员对这些细胞系生产人源化糖蛋白的能力和提高重组蛋白表达水平的能力进行更加全面的分析。这样的分析很重要，因为这两种类型的经过改进的杆状病毒表达载体的宿主都没有使用大量的不同外源蛋白 Z 糖蛋白对其进行广泛的评估。事实上，已有关于 MIMIC(SfSWT-I) 细胞不能够将一种特别的外源糖蛋白，马的黄体生长激素/域毛膜促性腺激素（equinelutenizinghormone/chorionicgondotropin)(LegardinieretaL，2005) 唾液酸化的报道。这两种马的糖肽类激素是由相同的基因编码的，因而有相同的氨基酸序列。根据对天然产物（Smithetal.，1993)N-连接糖蛋白特征的分析，你会预期 MIMIC(SfSWT-l) 细胞产生的重组激素在末端有 a2,3-连接的唾液酸残基。因此，:Legardmier 与他的同事获得的结果很可能反映了 MIMIC(SfSWT-1) 细胞不能对马的促黄体生长激素/绒毛膜促性腺激素进行 a2，3-连接形式的唾液酸化，之前从未对该细胞的这种能力做过评价。事实上，最近我们发现, 尽管 MIMIC(SfSWT-1) 细胞编码并表达鼠的 a2,3-唾液酸转移酶 U2，3-sialyltransferase), 但却未检测出细胞中有该酶的活性 (数据未给出）。现在清楚了 MIMIC(SfSWT-l) 细胞不具有对所有目标外源N-糖基化蛋白进行唾液酸化的能力。研究人员正在尝试构建新的细胞系，它可以进行 a2,6-和a2,3-唾液酸化。但是，一种具有 a2,3-唾液酸转移酶活性的新转基因昆虫细胞系也有可能不能唾液酸化所有的目标糖蛋白。而且，如果在 VE 细胞和其他的作为杆状病毒表达载体改进的宿主的转基因细胞系中都出现这种局限, 不要感到惊讶。
八、杆状病毒的基本操作方案
本书第一版的第 10 章中就已经包含了许多重要的关于杆状病毒转移质粒构建、昆虫细胞培养、杆状病毒表达载体的生产、分离和鉴定的较为详细的操作方案，还有在杆状病毒-昆虫细胞培养体系中表达重组蛋白所需的分析方法 (Bradley,1990), 这些至今仍然可以使用。此外，也相继出版了大量有关杆状病毒-昆虫细胞培养体系的书籍，这些书籍或其章节都有详细的技术方案（KingandPossee,1992;Murhammer，2007;O’reillyetal.，1992;Richardson，1995;SummersandSmith，1987)。最后指出，对于本章中提到的那些为便于制备和分离重组杆状病毒表达载体而构建的新型杆状病毒转移质粒和杆状病毒基因组骨架，每个构建者都提供了详细的图谱、序列和使用所需的分步操作方案，这些都可以从他们的网站免费得到。相应地，我也选择了一些在我们实验室使用的, 相对小型的，但都是必须的一套经过数次检验的技术方案和大家分享, 这些技术方案来源于 Summers和Smith(1987)及 O7ReiUy 等(19)编写的杆状病毒使用者「手册」，但在某些部分，根据我们的需要进行了适当地改良。对于本章提到的任何具体方法，转移质粒和亲代杆状病毒载体，读者可以参考下面给出的来源去获取有关的直接详细信息, 此处就不再进行复述了。
昆虫细胞的培养
我们通常在125 mL 的DeLong 摇瓶（Bellco) 中培养 50 mL 的Sf9细胞培养物，不论使用有血清或无血清培养基。对于有血清培养, 我们使用添加了 10%(V/V) 胎牛血清 (HyClone)和 01% 聚醚 F68(pluronicF68)(Sigma-Aldrich)的 TNM-FH 培养基；对于无血清培养，我们使用 ESF921(表达系统）。在我们的细胞培养中，我们既不将胎牛血清进行热灭活，也不在培养基中添加抗生素，因为使用我们的标准共挑选方法(standardcoselectionapproach) 进行转基因亚克隆的构建时，它们会产生干扰（HarrisonandJarvis，2007a;JarvisandGuarino,1995)。在每周的周一、周三和周五, 我们将培养的细胞传代，在周一和周三，Sf9细胞的接种密度为 0.5X106 个细胞/mL, 在周五为 0.3X106 个细胞/mL。使用标准的台盼蓝染色排除法在血细胞计数器上检测细胞密度（Murhammer,2007)。在摇瓶培养中 Sf9细胞的活力应维持在较高的水平，其倍增时间应在 24 h 左右。
对于更大量的细胞, 其培养可进行如下放大:100 mL 的细胞在 250 mL 的DeLong 摇瓶中进行培养，200 mL 的细胞在 500 mL 的DeLong 摇瓶中，或者 800 mL 的细胞在 2.8L 的 Fembach 瓶子(Bellc0) 中培养。转基因的昆虫细胞系的接种密度各有不同，通常均高于Sf9细胞的接种密度。在我们最近的实践中，以与 Sf9细胞相同的接种密度接种转基因的昆虫细胞系，它们的生长会变慢并且/或者经历一个暂时的停滞，之后再开始以正常速率生长。
杆状病毒基因组DNA的分离
除非你可以一直购买商业来源的已经纯化过的病毒DNA，因为分离出足够纯度的杆状病毒基因组DNA是制备重组杆状病毒表达载体的一个重要方面。采用差速离心方法，我们可以从芽生病毒(buddedvirus)中分离出病毒DNA。使用合适的亲代病毒感染 S9细胞，为避免缺失性干扰粒子（defectiveinterferingparticle)的产生（Kooletal.，i9；n)，应使用较低的感染复数 (如 o.Oi 空斑形成单位/细胞）。如上所述，采用加有胎牛血清和普朗尼克(pluronic)F68 的 TNM-FH 培养基培养细胞 3~5 天，并在相差显微镜下监控细胞的病理学征兆。一旦观察到明显的感染迹象，立即将感染的细胞在无菌的条件下转移到一次性使用的离心管中，大约 1000ul 离心 15 min。将澄清的上清液转移到超速离心管（如 33 mL 的BeckmanSW28 离心管）中，之后将含有 5 mmol/LNaCl和 10 mmoI/LEDTA的 25%(m/V) 蔗糖溶液小心地加入离心管底部 (如 3 mL 的BeckmanSW28 离心管）。再将离心管以 4°C, 大约 100000 g 离心 75 min(如对于 BeckmanSW28 转子，可采用 28000r/min)，之后，将上清液倾出，留下芽生病毒的沉淀块。使用蓝色枪头 (剪掉尖端，以具有较大的口径) 加入一定量的裂解缓冲液 (每毫升的初始感染性病毒培养基中加入 0~ImL) 温和重悬病毒沉淀，裂解缓冲液的组成为 10 mmol/L Tris(pH7.6)、10 mmol/L EDTA 和 0.25%(m.V)SDS。然后向其中加人蛋白酶 K(10 mg/mL, 溶于水）至终浓度为500jug/mL, 将其置于 37°C 孵育，间或旋转，直至溶液变得澄清, 这个过程通常需要 4 h 到一整夜。如果溶液仍是比较浑浊的, 那么应加入更多的裂解缓冲液和蛋白酶 K。将所得溶液依次釆用苯酚和苯酸-氯仿进行温和的抽提，之后，在0.3mol/L 乙酸钠存在下通过乙醇沉淀病毒DNA。最后, 使用 TE 重悬 DNA 沉淀 (相对每毫升的初始培养物加入 10fxL 的 Tris-EDTA 缓冲液进行重悬)。重悬的病毒DNA 浓度可采用分光光度计进行估测，但是，我们发现其非常不可靠。所以，我们一般通过对比法来使该估值更精确: 使用 Ec0RI 或Hhdin 消化 10 的病毒DNA，然后将消化产物与已知浓度的商业化 DNA分子质量标准进行琼脂糖凝胶电泳，接着以溴化乙锭或其他 DNa 染色方法染色。应该注意的是，这种方案与 o，Reilly 与其同事（O’reillyetal.，1992)在杆状病毒表达载体使用手册中所描述的方案在本质上是一样。
杆状病毒的空斑分析
总的来说，空斑分析是病毒学的一个重要方面。它是确保重组病毒以单一克隆形式被分离出来的最佳方法。进行空斑分析的准备工作包括两个互相独立的步骤:①在培养皿中预接种指示细胞;②将病毒储存液进行一系列的 10 倍梯度稀释。如上所述, 我们使用在摇瓶中培养的处于对数期生长期的S9细胞进行接种, 该细胞的生长培养基为含有 10% 胎牛血清和 0.1% 普朗尼克 F68 的 TNM-FH。将所需数目的细胞温和离心后丢弃旧的培养基，然后使用新鲜的无添加物的 TNM-FH 重悬细胞, 最后将细胞以 0.75XIO6个细胞/孔的密度接种于 6 孔细胞培养板 (corning)。在 28°C 下 I 障育 Ih 以使细胞沉降并贴附于培养板的塑料内壁。相对于培养基中有血清时，培养基中无血清时细胞会更加紧密地附着于培养板。在细胞进行贴壁时，可以将病毒储备液进行一系列的 10 倍梯度稀释，该稀释建立在一个假设之上，即病毒储备液具有的噬斑实验滴度为IXlO7pfu/mL。
我们采用含有胎牛血清和普朗尼克 F68 的 TNM-FH 作为稀释液，0.ImL 的病毒液加人 9.9 mL 的稀释液后为 100 倍的稀释,0.5 mL 的病毒液加入 4.5 mL 的稀释液后为 10倍的稀释。设置好空白稀释液后在无菌的条件下进行稀释，每次转移溶液后采用涡旋混合器混匀。在完成稀释和细胞已经贴附于培养板后进行细胞接种，每个稀释度接种两个细胞孔。将细胞孔中的培养基移除后每孔加入 2 mL 的病毒稀释液。这是该实验中的关键步骤，因为细胞会很快干掉，如操作太慢, 培养皿边缘的细胞将会死亡。所以，每次最好只移除两个孔的培养基，并立即加人相同浓度的病毒稀释液，然后，再进行下一对细胞孔和下一个稀释浓度的操作。我们一般采用 10_5、10—6 和 10_7 的病毒稀释度进行感染，以便于得到合理数目的空斑用于计数。再将病毒与细胞置于 28°C 孵育 Ih 以使病毒吸附于细胞，这期间应同时制备覆盖培养基 (overlaymedium)。我们准备了一个 125 mL 的瓶子，瓶子装有 50 mL2%(m/V)的溶于水的Seaplaque 低熔点琼脂糖 (Cambrex), 将该瓶进行高压灭菌, 随后使琼脂糖凝固。所得的瓶装固态琼脂糖可以采用微波处理使其再次融化, 之后冷却到大约 60°C 与等体积的已经预热到 30°C 的 2XGrace、培养基 (每孔需要 3 mL) 混合。如果使用蓝、白斑筛选来帮助鉴定假定的重组病毒，那么，此时应将显色底物加入覆盖培养基中。接着将覆盖培养基进行涡旋混合以获得均匀的混合物，再冷却至 40~42°C。最后，将感染的细胞从孵育箱取出，使用移液管彻底吸出病毒接种物，并将 3 mL 的覆盖培养基从孔的边缘缓慢地加人到培养孔。同样的，每次先吸出 2 个孔的病毒接种物，再相应加人覆盖培养基，之后进行下一组的操作，避免细胞脱水和死亡。放置 15 min 以使覆盖培养基变硬, 将培养皿置于封闭的塑料袋中，颠倒后于 28°C 孵育 7~10 天。使用解剖显微镜观察空斑并仔细计数, 使用所得的空斑数、稀释倍数及感染体积来计算原始病毒储存液的滴度。
