质粒的转化及转化子的鉴定实验——热激法
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中,实现重组克隆的增殖,便于后续分子操作(1)用于基因的克隆增殖;(2)筛选目的细胞。
实验方法原理 | 热激法:大肠杆菌在0 ℃ CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42 ℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中,重组子基因得到表达,在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. l ml X-gal (20 mg/ml),25 ml Amp(100 mg/ml),250 ml制备选择性培养基平板:在融化的250 ml LA培养基中250 mI PTG (200 mg/ml),混匀后倒入灭菌培养皿中; |
注意事项 | 1、利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时,用转化细胞铺平板的密度要低(90mm平板上不得超过105个菌落),同时37℃培养不应超过20小时,具氨苄青霉素抗性的转化体可将-内酰胺酶分泌到培养基中,迅速灭活菌落周围的抗生素,从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 2、 鉴定转化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有: 1) 互补; 2) 杂交筛选; 3) 插入失活(一些老质粒如pBR322等); 4) 小量提取质粒酶切检测、PCR检测 展开 |
其他 | 转化后,可以根据质粒上带有的某种特殊基因的表达来鉴定菌落,最常用的有:抗药性基因的表达,比如质粒带有氨苄抗性基因,能在AMP平板上长的一般可以初步判断为转化成功的菌;还有就是显色筛选,比如质粒上的LacZ基因表达,间接促使添加了X-gal的培养基变蓝,绿色荧光蛋白基因表达后菌落发荧光等。 |