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【Nature】重磅！首份拟南芥的整合蛋白质组、磷酸化蛋白质组和转录组图谱

鹿明生物

2021.7.24

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植物模式生物拟南芥革新了我们对植物生物学的理解，并影响了生命科学的许多其他领域^[1]。来自拟南芥的认识也提供了对作物重要农艺性状的机械理解^[2]。拟南芥基因组测序工作早在20年前就完成，此后在基因组和表观基因组水平上分析了数百个自然变异^[3]^[4]。相比之下，作为大多数生物过程的主要执行者的拟南芥蛋白质组特征研究远没有那么全面。

为此，德国慕尼黑工业大学Kuster研究团队及其他多家合作单位的研究者在Nature发表了题为“Mass-spectrometry-based draft of the Arabidopsis proteome”的文章，绘制了拟南芥的30种组织的转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组的定量图谱。初步回答了有多少基因以蛋白质的形式存在（超过18000个），它们在哪里表达，大约数量（超过6个数量级的动态范围）和被磷酸化程度（超过43000个位点）。

1.拟南芥多组学地图集

作者首先通过非标记鸟枪法定量蛋白质组学和RNA-seq分析了30种拟南芥组织样本。RNA-seq一共检测并定量到27655个蛋白编码基因；而质谱一共定量到18210个蛋白，平均覆盖了每个组织表达基因组的66%，与UniProt（27%）中报道的蛋白质水平上有证据的基因百分比相比，这是一个显著的增加，且是早期组织蛋白质组分析中鉴定的蛋白质数量的两倍多。

作者进一步系统分析了30种拟南芥组织的磷酸化蛋白质组，使用经典的IMAC技术用来富集磷酸化多肽，然后分馏为4个馏分，继而使用QE-HF进行110分钟梯度的非标记鸟枪法质谱分析，共计鉴定到43903个具有不同的可信度的磷酸化位点，使这项研究成为迄今为止发表的最全面的拟南芥磷酸蛋白质组之一。

图1 | 拟南芥组织图与多组学（蛋白组、磷酸化蛋白组、转录组）数据集

2.组织中蛋白质含量的调节

基于以上数据，作者探索了转录水平和蛋白水平的相关性。给定基因的蛋白含量由一个包含合成代谢和分解代谢转录、翻译和翻译后过程的调控系统决定。这在单细胞有机体和现阶段人类中得到了广泛的研究。作者发现在大多数组织中转录本和蛋白质水平呈正相关，大多数高丰度或低丰度转录体分别产生高丰度或低丰度蛋白质。

为了进一步确定蛋白质丰度的决定因素，作者实施了一种模型选择方法，并测试了每一个特征在组织特异性或全局水平上解释蛋白质水平变化的潜力。除了众所周知的预测因子，如转录水平和密码子使用、进化保护、mRNA序列模体和蛋白质相互作用的数量是蛋白质水平的重要预测因子。蛋白质与转录本丰度图清楚地表明，同样丰度的转录本往往导致蛋白质丰度相差100倍以上。基因的蛋白质与mRNA比率（PTR）的差异可能是由于给定转录本的翻译效率、转录稳定性或相应蛋白质稳定性的差异所致。例如生长素不稳定的AUX/IAA蛋白家族成员（如IAA8和IAA13）在高转录水平的情况下显示低蛋白信号，且被认为受到生长素依赖性蛋白酶体降解的严格控制。对于不同组织也表现不一，种子中PTR低的基因主要表现出蛋白质水平丰度差异，用cycloheximide（CHX）或MG132处理的萌发中种子经过长时间检测蛋白质水平显示，低PTR蛋白在种子萌发后从储存的mRNA中快速翻译，具有高PTR的蛋白质并没有表现出这种行为，这表明它们被储存在种子中以便于随时萌发。因此，拟南芥大量转录组信息可用于估算相对蛋白质丰度。

图2 | 蛋白质和转录本表达水平分析

3.拟南芥磷酸化蛋白质组

作者认为组织中激酶和P-位点共出现的信息，以及外部共定位或相互作用的信息，预计该磷酸化蛋白组数据集有助于在未来解开激酶-底物和激酶-P-位点的关系。总的来说，每种蛋白质的P-位点的数目显示出巨大的差异。例如，LEA蛋白家族的成员其序列中几乎每一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基都存在磷酸化。虽然磷酸化的检测并不能直接给出某种功能结果，但提供了一个重要的起点。例如，脱落酸（ABA）受体RCAR10参与ABA信号级联，发现在四个位点有被磷酸化。

此外，作者产生了拟磷突变体（S113D和S32D），与野生型受体相比明显降低了对ABA的反应。第二个例子显示，作者研究了QKY（也称为MCTP15），一种定位于胞间连丝的蛋白质，参与花和角果的形态发生。由于在所有被检测的组织中都检测到了它的一个P位点（Ser262），并且在其他MCTP家族成员的第一个和第二个C2结构域之间发现了更多的P位点，作者推测磷酸化Ser262可能对QKY功能有影响。为了验证这一假设，作者在强QKY-9突变体背景中产生了表达拟磷和磷突变体QKY转基因的植物系。模拟磷蛋白而非突变蛋白结构挽救了花和角果突变表型，提示正常QKY功能需要Ser262位点被磷酸化。作者创造了迄今为止非常全面的，尽管还不完全的拟南芥磷酸化蛋白质组草图，并展现了此资源的许多用途。

图3 | 蛋白质磷酸化的归属功能

综上所述，此数据库的建立极大丰富和全面提升了现有拟南芥蛋白质数据库的信息量，并为表征拟南芥蛋白质、解析蛋白质修饰与互作关系提供了有力的生物信息学工具。

专家点评

利用整合组学策略建立拟南芥蛋白质修饰与互作图谱取得重要进展

自上个世纪50年代“中心法则”提出以来，科学家们不断应用生物化学、分子生物学和遗传学策略对其进行了阐释和完善。在植物科学研究领域，科学家们以模式植物拟南芥和水稻，以及其它重要农作物、经济作物和林木为材料，应用正向遗传学和反向遗传学策略，从认识单个基因功能到解析基因表达调控通路，不断深入地开展研究，越来越清楚地认识了植物生长、发育、繁殖，以及逆境应答的分子调控机理。

进入二十一世纪后，表观遗传学和结构生物学研究迅速发展，高通量测序技术、生物质谱技术和生物信息学不断完善，人们开始从系统生物学的水平，更加精准和全面地认识基因、蛋白质和代谢物的结构及其互作关系。在此过程中，定量蛋白质组学技术迅猛发展，生物质谱的灵敏度和扫描速度不断提高，刚刚在国际上推广使用的Thermo Fisher Exploris 480、Bruker timsTOF Pro和Sciex 6600+等型号的质谱仪，及其配套的性能不断优化的应用分析软件，使得由生物质谱获得的蛋白质（多肽）信息正在接近植物基因组数据的数量级。在全基因组范围内，开展高通量的蛋白质丰度、翻译后修饰和蛋白质互作的大数据分析，为获得植物信号与代谢通路的全息图谱提供了可能。

早在2008年瑞士苏黎世大学Baginsky研究团队在Science发表“Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics”文章以来，对拟南芥全基因组水平上的基因表达、蛋白质丰度与翻译后修饰最为系统和全面的阐释。该篇研究采取非标记鸟枪法技术策略，利用亲水性强阴离子交换色谱（hydrophilicstrong anion-exchange chromatography）结合Thermo-Fisher QE-HF质谱，建立了包括拟南芥18,210种蛋白质（占27,655蛋白质编码基因的66%）鉴定信息，以及4,3903个磷酸化修饰位点信息的数据库；同时，系统地揭示了蛋白质复合体的组织特异性和磷酸化调控的信号通路。蛋白质组学研究获得的高质量的质谱数据平均覆盖每种蛋白质44%的序列，这使得可以通过质谱鉴定到由可变剪接（splice variant）产生的蛋白质同工型（protein isoforms），其中80%的同工型多肽通过体外合成多肽得到了验证；同时，高序列覆盖度的质谱结果中鉴定到的51个短开放读码框（short open-reading frames, sORFs）也得到了合成多肽的验证。这些结果更新了拟南芥基因组与蛋白质数据信息。更重要的是，转录组与定量蛋白质组结果揭示了基因表达与蛋白质丰度在各器官间存在明显差异与动态变化，为进一步明确各器官间蛋白质功能特异性提供了重要信息。同时，转录本与蛋白质丰度的比较特征，揭示了两者在多数组织中呈现正相关性，也反映出不同组织中和不同基因间的基因转录稳定性、蛋白质翻译效率，以及蛋白质稳定性的差异。此外，新发现的旁系同源物共表达、蛋白质复合体，以及目前最详尽的蛋白质磷酸化位点也为认识组织器官功能特性，以及以激素和受体激酶介导的信号通路为代表的多个代谢过程提供了重要信息。

令人可喜的是，这项研究在模式植物拟南芥里建立起来的整合组学分析策略、蛋白质丰度与互作关系数据库，以及生物信息学工具，为研究其它植物的发育与逆境应答过程奠定了基础，非常值得在作物和林木相关科学问题的研究中借鉴。

文末看点

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