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项目文章 | 转录组学+双平台代谢组学分析不同季节柳杉针叶中萜类和类黄酮生物的合成差异

鹿明生物

2022.12.15

2022年7月,南京林业大学林学院林业遗传与生物技术教育部重点实验室在Frontiers in plant science（IF：6.627）期刊发表了题为“Transcriptome and Metabolome Analyses Reveal Differences in Terpenoid and Flavonoid Biosynthesis in Cryptomeria fortunei Needles Across Different Seasons”的文章，运用转录组学、双平台代谢组学技术阐述对季节性变化引起的柳杉（Cryptomeria fortunei）针叶代谢和转录组学变化的理解，为柳杉的适应机制及其代谢物的提取提供了参考，以揭示季节间柳杉针叶代谢反应的分子调控。

中文标题：转录组和代谢组分析揭示不同季节柳杉针中萜类和类黄酮生物合成的差异

研究对象：柳杉针叶

发表期刊：Frontiers in plant science

影响因子：6.627

发表时间：2022年7月

运用生物技术：非靶向代谢组学、转录组学

背景介绍

柳杉（Cryptomeria fortunei）是我国特有树种，生长迅速，木材特性优良，是传统药材。类黄酮和萜类化合物是其主要的药理成分，具有出色的解毒、抗氧化、抗真菌和杀虫特性，已被用作植物保护、化妆品和制药行业的原料。季节性变化（Seasonal changes，SCs）是全球环境变化的主要组成部分，日长、光照强度和温度在年度周期中发生巨大变化。SC会引起树木中代谢物和其他植物化学物质的变化，并改变植物萜类化合物的产生、烯烃含量以及抗氧化和抗菌特性。

代谢物谱直接反映了植物的整体生理生化状态，有利于研究植物的代谢过程，揭示植物对环境的适应性。转录组是一个物种产生的所有转录本的集合，可用于从整体水平研究基因功能和结构，揭示特定生物过程的分子机制。本研究综合代谢组学和转录组学方法用于差异表达基因（differentially expressed unigenes，DEGs）和差异代谢物（differentially synthesized metabolites，DSMs）之间因果关系的共表达分析；结合生物学功能分析，阐明关键基因和代谢产物，进一步阐明植物在特定生理生态条件下的适应和调控机制。

技术流程

主要内容

1.针叶的超微结构和生理指标有明显变化对针叶植物超微结构的观察表明，不同季节针叶植物的结构存在明显差异。夏季柳杉（SCC）叶绿体结构相对稳定，围绕在细胞内表面，叶绿体基底层密集堆积；冬季柳杉（WCC）叶绿体结构轻微变形，类囊体结构松散，叶绿体基粒数量和堆积层数量较低（图1G-L）。结果表明，WCC叶绿体结构的局部破坏降低了色素的含量，导致柳杉的不同形态表型。

图1 | 与柳杉针叶季节变化相关的生理指标和针叶超微结构

2.代谢组学揭示了柳杉针叶在不同季节的代谢物变化

为进一步研究不同季节柳杉针叶的代谢差异，分别用GC-MS代谢组学和LC-MS代谢组学的双平台代谢组学分析了柳杉针叶的非靶代谢物。GC结果中多元统计分析准确地将所有样品分为2个集群，反映了夏季和冬季针叶之间的明显差异（图2A-C）。共有63个DSMs在69条代谢途径中被富集，包括23条重要的代谢途径（图2E）。与SCC结果相比，WCC针叶中上调的DSMs在柠檬酸循环（TCA循环）、乙醛酸和二羧酸代谢和赖氨酸降解中显著富集（P < 0.05），下调的DSMs在氨基甲酸乙酯代谢中显著富集（P < 0. 05），也可富集到氨基酸-tRNA生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成和半胱氨酸和蛋氨酸代谢等代谢通路。

LC结果中多元统计分析显示，SCC和WCC针叶之间存在明显差异（图3A-C），共得到413个DSMs（图3E）。在这些DSMs中，有44个DSMs富集于45条通路，包括11条重要的代谢通路（图3F）。在WCC针叶中，上调的DSMs在类黄酮生物合成（FBP）、黄酮和黄酮醇生物合成和苯丙烷生物合成中显著富集（P < 0.05），而下调的DSMs在植物激素信号转导、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、酪氨酸代谢、磷酸戊糖、氰基氨基酸代谢和萜类生物合成（TBBP）途径显著富集（P < 0.05）。

图2 | 基于气相色谱-质谱法（GC-MS）的差异代谢物（DSM）分析

图3 | 基于液相色谱-质谱法（LC-MS）的差异代谢物（DSM）分析

3.柳杉转录组的富集分析

在WCC和SCC样本之间共鉴定了14,057个DEGs（WCC针叶中上调6137个，下调7920个）（图4A-B）。有5819个注释了GO功能，最丰富的亚类是细胞，其次是细胞部分；生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）中被注释最多的两个亚类分别是细胞成分或生物发生和代谢过程；细胞和细胞部分；以及催化活性和结合（图4C）。

为深入了解特定代谢物的合成、相关基因功能和多基因相互作用，作者对转录组学数据进行了KEGG富集分析。下调的DEGs被注释29条重要的（P < 0.05）途径，光合作用（photosynthesis，PP）和光合作用-天线蛋白（photosynthesis-antenna proteins，PPP）是两个最重要的途径；光合生物的碳固定、黄铜类固醇生物合成和二萜类生物合成也被显著富集（图4D）。上调的DEGs被注释为18条重要的（P < 0.05）途径，其中真核生物的核糖体生物生成和类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis，FBP）是两条最重要的途径（图4E）。

图4 | 差异表达的单基因（DEG）的功能分类

4.转录组和代谢组的综合分析
为探索潜在的调控机制，作者对KEGG通路注释的DEGs和DSMs进行Spearman相关分析。在排名前20位的基因中，14个与PP/PPP有关，3个与精氨酸生物合成和光合生物的碳固定有关，1个基因与MAPK信号传导途径-植物/FBP/RNA运输有关。排名前20位的代谢物分别与FBP、TBBP、光合生物的碳固定以及淀粉和蔗糖、氨基酸和TCA/不饱和脂肪酸的生物合成/抗坏血酸和醛酸代谢有关。代谢物被明确分为两类，I类（包括14种）和II类（其余6类）（图5）。同一类别的代谢物是正相关的，不同类别的代谢物一般是负相关的（图5）。因此，文章推测柳杉的季节性代谢差异主要与PP有关，其次是TBBP和FBP。

图5 | 前20个差异表达的单基因（DEG）和差异合成代谢物（DSM）的相关性分析

5.与PP、TBBP和FBP相关的基因鉴定
代谢组学、转录组学联合分析得知，不同季节柳杉针叶样本在PP、TBBP和FBP成分的表达上有很大的不同。共有56个DEGs与PP有关，28个候选DEGs参与了TBBP，分别参与了单萜、双萜、三萜、类胡萝卜素、玉米素的生物合成。这些参与类固醇生物合成和二、三萜类途径的基因，大部分在SCC针叶中被上调。37个DEGs与FBP有关，有12种代谢物对应也参与了FBP，12种代谢物中9种代谢物在WCC针叶中的含量对比于SCC针叶是上调的。
6.DEG表达的qRT-PCR验证为了验证转录组数据的可靠性，实验通过qRT-PCR测量了与光合作用、类黄酮生物合成和萜类化合物生物合成途径选定有关的18个基因的转录水平。这些基因的表达模式与通过RNA-seq分析得到的结果相似（图6）。这些结果为进一步研究柳杉针叶中参与光合作用、类黄酮和萜类化合物积累的关键基因提供了参考。

图6 | 参与柳杉针叶中光合作用、类黄酮生物合成和萜类化合物生物合成途径选定基因的qRT-PCR验证

内容总结

本研究发现SC对P(P)P、TBBP、FBP影响较大。通过转录组学和代谢组学联合分析，结果中TBBP的MEP通路中的基因在SCC针叶中高表达，促进萜类化合物，尤其是二萜类化合物的积累；相反，与FBP相关的基因在WCC针叶中高表达，促进类黄酮积累。研究探讨了SC对柳杉针叶代谢物的影响，提高了SC对植物组织中代谢物调节系统的理解。为提取植物代谢产物提供依据，也对富含萜类和黄酮类植物的遗传改良提供重要参考。

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