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Clin Transl Med | 鄢丹&林昊&孙志团队用代谢组学对糖尿病生物标志物筛选及图谱构建

鹿明生物

2021.7.30

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鹿明

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● 前言

2021年5月，首都医科大学附属北京友谊医院鄢丹课题组，电子科技大学林昊课题组，郑州大学第一附属医院孙志课题组等在《Clinical and Translational Medicine》期刊发表了题为“Integrated biomarker profiling of the metabolome associated with impaired fasting glucose and type 2 diabetes mellitus in large-scale Chinese patients”的研究成果，通过非靶向代谢组学和靶向代谢组学研究方法，进行了空腹血糖受损（IFG）和2型糖尿病（T2DM）的潜在生物标志物筛选，构建并评估了与IFG和T2DM相关并经过验证的综合生物标志物图谱（IBP），提供了该图谱用于糖尿病临床预测与治疗应用的可能性。

中文标题：大规模中国人群中与空腹血糖受损和2型糖尿病相关的代谢组学综合生物标志物分析

研究对象：人、血清

发表期刊：Clinical and Translational Medicine

影响因子：11.492

发表时间：2021.6

发表单位：首都医科大学附属北京友谊医院/电子科技大学/郑州大学第一附属医院

运用生物技术：非靶向代谢组学、靶向代谢组学、超高效液相色谱质谱联用平台（UHPLC-Q Exactive-Orbitrap HRMS、UHPLC-TSQ-Altis QQQ MS）

● 研究背景

2型糖尿病(T2DM)是导致糖尿病并发症和死亡的重要原因。包括空腹血糖受损(IFG)在内的糖尿病前期患病率约为中国人口的三分之一，但目前早期风险评估较薄弱。运用代谢组学识别糖尿病前期和T2DM的诊断生物标志物，创建与IFG和T2DM相关的综合生物标志物图谱(IBP)，在提高疾病风险预测能力与临床应用方面意义重大。

实验基于大量临床样本数据，通过非靶向代谢组学筛选和靶向代谢组学验证，对正常血糖耐受(NGT)、空腹血糖受损(IFG)、2型糖尿病(T2DM)、高脂血症(hyperlipidemia)处理组的生物标志物进行筛选与验证，构建能够客观反映疾病代谢谱的IBPs，避免了使用多个生物标志物混淆结果，也避免了单一生物标志物波动对整体诊断的影响。对受试者进行预测，干预或延迟IFG的进展，降低T2DM的发病率，为糖尿病患者的诊断或治疗提供帮助，此外，糖尿病疗效或药物治疗趋势可以通过给予治疗药物后的IBP反应来反映。综上，通过非靶向代谢组学与代谢组学技术可以在发现验证各组不同的生物标志物，促进糖尿病早期诊断和治疗方面起作用。

●研究技术路线

将中国五个中心共1705名参与者随机分配到发现阶段(n=153)，测试阶段(n=420)和验证阶段(n=1132），构建IFG和T2DM的综合生物标志物图谱，其中146名高脂血症患者作为干扰组，以评估综合生物标志物图谱的预测准确性。

在发现阶段，153名受试者被招募来筛选IFG、T2DM处理组候选生物标志物；NGT、IFG、T2DM受试者共420名在试验阶段测试生物标志物候选物；

在验证阶段，由792名受试者组成的独立试验用于构建NGT、IFG、T2DM、高脂血症组IBP预测模型，然后，用340名受试者的试验对IBP预测模型进行评估。

● 研究方法

1.实验材料

2018年1月至6月，为研究空腹血糖受损与2型糖尿病生物标志物，从5个临床中心招募正常血糖耐受(NGT)、空腹血糖受损(IFG)、2型糖尿病(T2DM)、高脂血症(hyperlipidemia)共1705人，将人群随机分配到发现、测试、验证三个阶段，发现阶段NGT、IFG、T2DM处理组共153人，测试阶段NGT、IFG、T2DM处理组共420人，验证阶段NGT、IFG、T2DM、高脂血症处理组共1132人，其中高脂血症组血糖正常。

2. 样品采集

血液样品在通宵禁食后于7:00-8:00采集，离心获取血清，-80℃保存，以待分析。

3.多组学分析

非靶向代谢组学分析在发现和测试阶段使用UHPLC-QExactive-Orbitrap高分辨率质谱仪串联。靶向代谢组学分析使用UHPLC-TSQ Altis三重四极杆质谱仪(UHPLC-TSQ-Altis QQQ MS)进行。

● 研究结果

1.1705名受试者在3个阶段的临床特征表现

各阶段受试者的临床特征如表，发现、测试阶段的NGT、IFG、T2DM处理组；验证阶段用于构建并评估IBP的NGT、IFG、T2DM、高脂血症处理组受试者，在数量、男性占比、女性占比、年纪、空腹血糖、体重指数、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、甘油三酯、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶各指标的含量占比。

表1 | 受试者的临床特征

数据表示为n (%)、平均值(标准差)。缩写:ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；BMI：体重指数；FBG：空腹血糖；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；IFG：空腹血糖受损；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；NGT：糖耐量正常；TG：总胆固醇；TC：甘油三酯；T2DM：2型糖尿病。

2.候选生物标志物主要代谢途径及其相互关系

3个阶段各处理组代谢物经过筛选和鉴定，在IFG和T2DM患者的禁食血清中分别筛选出31和42个候选生物标记物，基于Logistic回归和ROC结果，41种代谢物被认为是IFG或T2DM的潜在生物标志物。为了提高本研究中鉴定候选生物标志物的准确性，靶向选择了16种潜在生物标志物，进行分析。

生物标志物可能参与介导与胰岛素拮抗和胰岛β细胞功能障碍相关的糖尿病的发生和发展，因此，应用生物标志物来综合分析糖尿病的发展。如图所示，以三羧酸循环为中心，生物标志物显著增加或减少，代谢途径之间存在相互关系。

图1 | 候选生物标志物的主要代谢途径及其相互关系示意图

红色箭头表示显著增加，绿色箭头表示血清生物标志物(候选生物标志物(海蓝宝石框)和潜在生物标志物(绿框))显著减少。黑色箭头代表酶促反应的一个或多个步骤。

3.综合生物标志物分析

验证试验作者选择了三种方法（极端梯度提升[XGBoost]，LR和支持向量机[SVM]）。结果表明，XGBoost模型具有更好的预测性能（XGBAUC = 0.819，LRAUC = 0.791，SVMAUC = 0.789;图2A）。此外，使用基尼系数从靶向的16个潜在生物标志物中选择10个对IFG和T2DM疾病风险具有更好预测能力的生物标志物来构建IBP (XGBAUC = 0.823，图2B和C)，研究发现其由LPC (P-16:0)、L-异亮氨酸、L-精氨酸、左旋肉碱、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸和乙酰型肉碱组成(图2D)。构建IBP，从多个生物标志物的角度评估糖尿病风险，为IFG和T2DM发展提供了潜在的生物学机制基础。

图2 | 建立综合生物标志物图谱

A：LR、SVM和XGBoost模型的整合的16个潜在生物标志物的AUC。B：LR、SVM和XGBoost模型的整合的10个潜在生物标志物的AUC。C：基于XGBoost模型的方差、逻辑回归和基尼系数分析整合的16个潜在生物标志物的增量特征选择曲线。D：基尼系数的16个潜在生物标志物。缩写:AUC：曲线下面积；LR：逻辑回归；LPC：溶血磷脂酰胆碱；MI：相互信息；SVM：支持向量机。

4.综合生物标志物分析几个代表性样本的预测示意图

IFG与NGT、T2DM与NGT、T2DM与IFG、T2DM与高脂血症的辨别中，IBP的AUC值分别为0.804、0.936、0.823和0.937(图3)。IBP表明，NGT、IFG和T2DM的10种潜在生物标志物的浓度不同(图3)。基于XGBoost模型，未知的随机样本可能属于在NGT、IFG、T2DM和高脂血症组中具有最高预测值的组。例如，如果NGT、IFG、T2DM和高脂血症组的未知样本1的预测值分别为0.092、0.676、0.139和0.093(图3D)，代表它可能是IFG患者(图3C)。其他组中代表性样品的预测如图3所示。

图3 | 使用综合生物标志物分析的几个典型代表性样本预测示意图

代表性NGT (A)的示意图(未知样品1在NGT、IFG、T2DM和高脂血症中的预测值分别为0.795、0.075、0.066、0.064)、IFG (C) (0.092、0.676、0.139、0.093)、T2DM (E) (0.094、0.173、0.597、0.137)和高脂血症（G）（0.157、0.092、0.048、0.702）样品采用综合生物标志物分析。属于NGT (B)、IFG (D)、T2DM (F)和高脂血症(H)组的代表性样本的预测值。可以解释为未知样本属于具有最高预测值的组。浓度归一化后，实线:四组潜在生物标志物的平均值；灰色区域:平均标准差；虚线:未知样品中潜在生物标志物浓度的标准化值。缩写:Hyper：高脂血症；IFG：空腹血糖受损；LPC：溶血磷脂酰胆碱；NGT：糖耐量正常；T2DM：2型糖尿病

● 研究结论

通过临床样本数据，对正常血糖耐受(NGT)、空腹血糖受损(IFG)、2型糖尿病(T2DM)、高脂血症(hyperlipidemia)处理组潜在生物标志物进行筛选，再靶向验证评估。构建IFG和T2DM IBPs和与糖尿病前期和T2DM发生发展相关的公共服务网站，可以进一步提高本研究的潜在临床公共服务能力。

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本文作者运用LC-MS非靶向代谢组学报告了关于临床对空腹血糖受损(IFG)和2型糖尿病(T2DM)的代谢组学研究，揭示了IFG和T2DM中的代谢物特征。靶向代谢组学对潜在生物标志物进行验证，并构建综合生物标志物图谱（IBP），建立与糖尿病前期和T2DM发展相关的公共服务网站，在临床上对糖尿病早期预测防护与靶向药物的治疗验证方面意义重大。是一篇高质量的、典型的临床标志物研究文章，值得学习与借鉴。

文末看点｜lumingbio

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