假单胞菌转录调节因子AlgR通过非编码RNA RsmZ调控脂肪酶LipA表达探讨
上一篇 /
下一篇 2017-12-25 14:34:47/ 个人分类:非编码RNA研究
参考文献:The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5. Biochemical and Biophysical Research Communications(IF2.466)
关键技术:EMSA、基因敲除CRISPR-Cas9、lacZ报告基因
假单胞菌转录调节因子AlgR通过非编码RNA RsmZ调控脂肪酶LipA表达机制探讨
脂肪酶(Lipase)是一种存在于动物、植物、微生物中的工业用酶,广泛应用于食品、去垢剂、生物质能等领域。目前商品化的脂肪酶主要来源于微生物,但传统的育种、培养基营养优化的手段在提高其产量方面面临瓶颈,亟待从分子机制层面寻找解决途径。
目前研究证实细菌中脂肪酶的表达受到双组份调控体系如LipQ-LipR调节,但假单胞菌P. protegens Pf-5菌株的分子调控机制有待深入研究,AlgR作为转录调控因子在假单胞菌P. protegens Pf-5菌株中对于脂肪酶产量控制关系及机理此前还未见报道,同时已知AlgR也能够调节ncRNA RsmZ,故而本文采取基因敲除、lacZ报告基因、EMSA等方法研究AlgR对于lipA的表达调控机制。
研究内容及结果
1. 证实AlgR在转录水平控制lipA表达
构建了algR敲除的Pf-5菌株(名为Pf6003),培养测定其生长曲线,并检测对比敲除菌株中lipA酶活性。结果显示野生型、algR敲除型Pf-5菌株的呈现一致生长曲线,说明algR的敲除不影响Pf-5的生长(图A),但是敲除株的总脂肪酶活性显著下降(图B)。
此外将lipA的启动子连接lacZ报告基因、将报告基因质粒分别转入野生型及突变型Pf-5菌株,后续检测β半乳糖苷酶(b-galactosidase)活性,发现在敲除突变株中b半乳糖苷酶活性低于野生型(图C)。通过RT-PCR检测lipA的mRNA表达,显示突变株中lipA mRNA水平降低(图D)。
同时通过lacZ报告基因实验显示algR的补偿过表达在野生型和缺失突变型Pf-5中都能提高β半乳糖苷酶活性及lipA酶活性。
2. AlgR影响rsmX/rsmY/rsmZ的表达
使用RT-PCR实验证实在Pf-5菌株中敲除AlgR基因后,rsmX/rsmY/rsmZ的转录水平均上调。
3. AlgR直接结合于rsmZ启动子序列
本文表达纯化了AlgR蛋白、合成了rsmX/rsmY/rsmZ启动子序列的探针,进行EMSA实验验证AlgR蛋白同这些基因启动子序列的互作关系,证实AlgR蛋白存在直接相互作用、而AlgR蛋白不能结合于rsmX/rsmY的启动子序列。
5. AlgR通过rsmZ调节lipA的表达
构建了rsmZ敲除的Pf-5菌株(名为Pf6285),并构建了同时双敲除algR和rsmZ的Pf-5菌株(名为Pf6100),通过lazZ报告基因及酶活力测定显示,同时敲除algR和rsmZ基因的Pf6100中lipA表达及总酶活性显著低于algR单独敲除的菌株,而在algR单独敲除株中过表达rsmZ能够使lipA酶表达及活性恢复到野生型水平。
总结
构建了分别单独敲除algR或rsmZ的假单胞菌株Pf-5,及同时敲除algR和rsmZ的菌株,通过lacZ报告基因系统以及细胞总酶活力测定,证实了algR的缺失突变导致lipA水平下降,同时rsmZ的过表达能够补偿algR缺失对于lipA的下调效应,并通过EMSA实验验证了AlgR蛋白能直接结合于rsmZ的启动子序列,说明algR基因是通过rsmZ来调控假单胞菌株Pf-5中lipA的表达水平。
本文采取基因敲除Cas9、lacZ报告基因、EMSA等方法研究AlgR对于lipA的表达调控机制,在表观遗传调控、非编码RNA、蛋白互作等的应用极其成熟,可@qq3268908524索取文献全文及服务沟通......
相关阅读:
- 仅需1个长非编码RNA变化足以逆转细胞衰老 (18401265725, 2018-1-10)
- CRISPR/Cas9蛋白切割DNA过程中的调控和校验机制 (18401265725, 2018-1-12)
- 无需新gRNA质粒的CRISPR/Cas9高效基因组编辑技术:CAGO (Chloe, 2018-2-06)
- 新版CRISPR技术有望根治亨廷顿舞蹈症 (huguangshuo, 2018-2-28)
- 新版CRISPR技术有望根治亨廷顿舞蹈症 (huguangshuo, 2018-3-06)
- 最新Nature:“升级版”Cas9,让基因编辑更灵活精确 (huguangshuo, 2018-3-06)
- 科学家发现弯曲菌中的CRISPR-Cas9系统或能有效切割RNA分子 (huguangshuo, 2018-3-08)
- CRISPR-Cas9基因治疗法基础知识ABC (release, 2018-3-08)
- 美两独立团队改进CRISPR-Cas9方法 有望根除基因疾病 (release, 2018-3-08)
- CRISPR实验指南:如何检测CRISPR脱靶突变(一) (18401265725, 2018-3-14)
导入论坛收藏
分享给好友
推荐到圈子
管理
举报
TAG: cas9emsalacz非编码rna