| 实验步骤 | 阶段 1: 反转录酶催化合成 cDNA 第一链
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
放线菌素 D:
只在使用带有 RNaseH 活性的野生型 Mo-MLV 反转录酶时才需要用放线菌素 D。见第 7 章信息栏“放线菌素 D”。
二硫苏糖醇（DTT 1mol/L)
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
KCl(1mol/L)
MgCl2(1mol/L)
Tris-Cl(1mol/L, 室溫 pH8.3)
酶和缓冲液
反转录酶
有数家厂商供应重组的鼠源反转录酶。我们强烈推荐没有 RNase H 活性的突变体酶（如 Life Technologies 公司产的 SuperscriptⅡ反转录酶)。正如在信息栏“Mo-MLV 反转录酶”中所讨论的，反转录酶制剂的比活决定于在大肠杆菌表达此酶所用的特定 cDNA 克隆, 有关酶的情况可査阅每一个厂商的说明书（如每微克 poly（A）+RNA 加入的酶单位数，反应温度）。更多的资科参见本方案结尾处的疑难解答“cDNA 第一链合成的优化”。
Mo-MLV RT 对温度敏感，应-20°C 保存直至步骤 1 需用前才取出。
RNase 抑制剂（选用）
RNase 的蛋白抑制剂可与大多数 RNase 结合并抑制它们的活性，但并不影响 Mo-MLV RT 中的 RNaseH 活性。几家厂商销售这些抑制剂，并给以不同的商品名称。（如 Promega 公司产的 RNAsin 和 5prime→3prime 公司产的 Prime Inhibitor)，详见第 7 章信息栏“RNases 抑制剂“。
核酸和寡核苷酸
dNTF 溶液，含有所有四种 dNTP，每种浓度为 5 mmol/L
用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物（1mg/ml)
通常用随机六核苷酸和 oligo(dT）12~18 或者这两种引物的混合物引发 cDNA 第一链的合成。对定向克隆, 通常使用引物-衔接子，其一般结构为 5'P(dX)-(dR)-(dT)x-OH3', 这里 X 由 4 个核苷酸组成（通常为 GAGA)，R 为限制性内切梭酸酶识别位点，（dT)x 为用于定向克隆的由 15(dT) 残基组成的多聚物。Oligo(dT)12-18 以 10 倍（Mo-MLV H-) 和 40 倍（Mo-MLV) 过量的摩尔数存在于第一链合成的反应混合物中，与随机六聚体和引物-衔接子（见下文）不同，Oligo(dT)12-18在反应混合物中的浓度通常不需要优化。随机六聚体在反应混合物中的浓度是很关键的。随着六聚体与 mRNA 比率的增加，cDNA 平均长度随之减少。所以在一系列含有放射性标记 dCTP 的预备实验中优化随机引物和 mRNA 模板的比例是必需的。在每一个预备实验中所产生的 cDNA 第一链的平均长度应当用巳知分子质量大小的 DNA 参照物作对照，通过碱性琼脂糖凝胶电泳和放射自显彩进行检测，当扩大规模大量合成 cDNA 第一链时，要使用能产生最大 cDNA 平均长度的最高随机引物与 mRNA 比。
使用引物-衔接子一般比使用随机引物引起的麻烦少，但是在一系列含有放射性标记的 dCTP 的预实验中，仍然需要慎重地优化引物-衔接于与 mRNA 模板的比例，每一反应中所合成的 cDNA 量按照本方案步骤 5 和 6 所述方法进行测量。当扩大规模大量合成 cDNA 第一链时，要使用能产生最大产量 cDNA 时的最低引物-衔接子与 mRNA 比。
制备引物贮存液（1 mg/ml,10 mmol/LTris-HCl[pH7.4] 配制），将溶液分装，贮存在-70°C。
poly(A)+RNA(1 mg/ml)
合成足量双链 cDNA 以构建大的文库时，一般需要 5~10ug poly(A)+RNA(—个 90 mm 大小的方瓶，培养哺乳动物细胞长成致密单层可产生 1~2ug poly(A)+RNA)。如果棋板用量较少，仍可有效地进行合成反应，但方案中毎一阶段 cDNA 的损失将成比例增加。当用有限数量的细胞制备文库时，参见本章末信息栏“从少量细胞构建 cDNA 文库"。
在开始构建 cDNA 文库前，应当用下述方法对所用 poly(A)+RNA 的完整性进行检査。（1）琼脂糖凝胶电泳和用对照探针进行 Northern 杂交（见第 7 章方案 5 和 8）。（2）在无细胞翻译系统中进行翻译，对产生的多肽进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。（3）对预实验反应中合成的 cDNA 第一链的大小进行分析 (见本方案末疑难解答“cDNA 第一链合成的优化”）。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dATP 和 [a-32P]dTTP 作为监视 cDNA 第一链和第二链合成的放射性示踪剂，因为它们偏爱掺入到对应 mRNA3'端 poly(A)+尾的 cDNA 中。在本方案中，不要使用贮存超过两周的 [a-32P]dCTP。
在开始本方案前，才能冻融 [a-32P]dCTP, 将融化的放射性标记的 dCTP 存放在冰上直到步骤 2 需用时。使用后必须立即将放射性标记的 dCTP 放在冷冻室内。
重要：Stratagene 产的 cDNA 合成试剂盒中推荐，在其方案中除不能用 dCTP 外，任何标记物都可以使用。试剂盒内的 dNTP 混合物中含有 5-甲基 dCTP, 这样可保护cDNA 内郁的 XhoⅠ识别位点不被 XhoⅠ降解，因为 XhoⅠ常用来产生供连接用的 XhoⅠ末端。在 Stratagene 公司的方案中使用放射性标记的 dCTP, 可在 cDNA 内部产生不能被保护的 XhoⅠ位点。
专用设备
微量离心管，无 RNase
预设温度为 16°C 和 70°C 水浴
附加试剂
本方案步骤 5 所需试剂列在第 5 章方案 8。
方法
1. 在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行 cDNA 第一链的合成:
poly(A)+RNA(1ug/ul) 10ul
寡核苷酸引物 (1ug/ul) 1ul
1mol/LTris-HCl(pH8.0,37°C) 2.5ul
1mol/LKCl 3.5ul
250 mmol/LMgCl2 2ul
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 毎种 5 mmol/L) 10ul
0.1mol/LDTT 2ul
RNase 抑制剂（选用） 25 单位
加 H2O 至 48ul
然后在反应物中，加人厂商推荐的 Mo-MLV H- RT 的用量，温和振荡混合反应物反转录酶是用含 Triton X-100 或 NP-40 和 50% 甘油的缓冲液配制的，因此避免气泡产生有时是困难的，但应尽量避免产生气泡，必要时，可用微量离心机稍稍离心一下，除去气泡。
Mo-MLV RT 对温度敏感，应保存在-20°C。直到需要使用为止。
重要：如使用 AMV RT 制剂，反应条件见表 11-3。
2. 当所有反应组分在 0°C 混合后，取出 2.5ul 反应液转移到另一个 0.5 ml 微量离心管内。在这个小规模反应管中加入 0.1ul[a-32P]dCTP(400Ci/mmol,10mCi/ml)。
3. 大规模和小规模反应管都在 37°C 温育 lh。
对于某些 Mo-MLV RT 突变体，可采用较髙的温度（高至 55°C）。若 mRNA 含有广泛的二级结构，较高的温度下反应能增加 cDNA 合成的产量。然而，在 55°C 合成的 cDNA 平均长度较在 37°C 合成的短。
4. 温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入 1ul 0.25mol/LEDTA, 然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在 70°C 温育 10 min, 然后转移至冰上。
在大规模反应管中所合成的 cDNA 可直接用作 PCR 反应的模板。如果 cDNA 第一链用作合成 cDNA 第二链的模板，应在进行步骤 5 和步骤 6 同时，准备好第二链合成所需材科和 16°C 水俗。
5. 按附录 8 所述方法，测定 0.5ul 小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸 (TCA) 沉淀的放射性活度。此外，用合适的 DNA 分子质量参照物通过械性琼脂糖凝胶电泳（参阅第 5 章方案 8) 对小规模反应产物进行分析是值得的。
cDNA 第一链应呈大小约 0.7kb 到 6kb 以上的拖影，多数在 2kb 左右。
小规模反应残留物保存在-20°C。
6. 按下述方法计算 cDNA 第一链的合成量：
a. 在大规模 cDNA 合成反应中，使用 10ul 含有 4 种 dNTP 的溶液，每种 dNTP 浓度为 5 mmol/L(即 10ul 20 mmol/L 总 dNTP) 所以大规模反应中必定含有
20nmol/ul dNTPx10ul=200nmol dNTP
b. 因为渗入到 DNA 中的每种 dNTP 的分子质量大约是 330 g/mol, 因此反应所能产生的 DNA 总量为：200nmolX330ng/nmol=66ugDNA。
c. 根据小规模反应的结果，计算所得 cDNA 第一链合成量为
如反应良好，cDNA 第一链的产量应是反应混合物中所用 poly(A)+RNA 量的 30%~40%。
另一种监视 cDNA 第一链合成情况的方法是在上面所述的大规模反应中，加入少量 [a-32P]dCTP(总量为 10uCi)。在随后 cDNA 的第二链合成反应中，加入更大量的放射性标记的 dNTP, 总置为 100uCi,—般不希望采用这种方法，因为随后必须将碱性琼脂糖凝胶于 X 射线胶片上长时间曝光以获得 cDNA 第一链产物的合适成像。
7. 尽可能快地进行 cDNA 合成的下一步骤
阶段 2:cDNA 第二链的合成
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
氯仿
EDTA(0.5mol/LpH8.0)
乙醇
MgCl2(1mol/L)
(NH4)2SO4(1mol/L)
将 1.3 g 固体硫酸铵溶解于终体积为 10 ml 的水中，溶液经滤膜过滤除菌后，贮存于室溫。
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD)(50 mmol/L)
将 33.2 mg β-NAD 溶解于 1 ml 水中，制成 50 mml/L 的贮存液，分装后贮存于-70°C。β-NAD 除可作为电子受体外，也是大肠杆菌 DNA 连接酶的辅因子。不要将其与α-NAD 混为一谈。
酚：氲仿（1:1，V/V)
RNase H 缓冲液（选用）
20 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)
20 mmol/L KCl
0.1 mmol/L EDTACpH8.0)
0.1 mmol/L DTT
只有进行步骤 1 的备选步骤时，方需使用此缓冲液，
乙酸钠（3mol/L,pH5.2)
10XT4 多核苷酸激酶缓冲液
TE(PH7.6)
Tris-HCl(2mol/L,pH7.4)
酶和缓冲液
T4 噬菌体 DNA 聚合酶（2.5 单位/ul)
T4 噬茵体多核苷酸激酶（30 单位/ul)
大肠杆菌 DNA 连接酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I
RNase H
有数家厂商出售来自大肠杆菌的 RNase H 纯品，其比活需达到约 1000 单位/ml。
核酸和寡核苷酸
dNTP 溶液（含有 4 种 dNTP, 每种浓度为 10 mmol/L)
cDNA 第一链
使用按本方案步骤 1 制备的第一链大规模反应混合物。
参照物
见本方案末疑难解答"cDNA 第二链合成的优化"。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dTTP 作为监视 cDNA 第二链合成的放射性示踪剂。因为它们可能偏爱掺入到对应于 mRNA3'端 poly(A)+尾巴的第二链部位。
在开始本方案前，才能融化 [a-32P]dCTP, 将融化的放射性标记的 dCTP 存放在冰上直到步骤 1 需用时。使用后必须立即将放射性标记的 dCTP 放在冷冻室内。
专用设备
SephadexG-50 离心柱
将知 Sephadex G-50(中等大小孔径）加到无菌水中（10 g 干粉产生 160 ml 悬浆）。用无菌水清洗膨胀的树脂数次以除去可溶的葡聚糖，否则在乙醇沉淀时由于沉淀可造成问题。最后用含有 10 mmol/L NaCl 的 TE(pH7.6) 溶液平衡树脂，高消毒 [10 psi(0.70 kg/cm3)15 min] 并储存于室温。预装好的 Sephadex 柱和其他凝胶过滤树脂有商品销售。
预设温度为 16°C 的水浴
方法
用 RNaseH 和 DNA 聚合酶 I 催化合成 cDNA 第二链会导致 mRNA 模板 5'端序列的缺失（约 20 个核苷酸)。这是因为在 DNA 聚合酶 I 起始合成第二链前，RNaseH 降解了 mRNA-DNA 杂合体的 5'序列（D'Alessio and Gerard 1988)。大多数真核 mRNA 的 5'端含有一大段非翻译序列，因此缺失相当于 5'端 20 个核苷酸的 cDNA 克隆对大多数研究者将不会产生有害结果。另外，对于那些对 5'端序列非常关心的研究者，我们提供了一种步骤 1 的备选方法，可减少 cDNA 克隆失去 5'端的危险。不幸的是，这种方法可导致双链 cDNA 产量降低，所以大多数研究者愿意选择步骤 1 的标准方法。
1. 将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中（阶段 1, 步骤 4):
10 mmol/L MgCl2 70ul
2mol/LTris-HCl(pH7.4) 5ul
10mCi/ml[a-32P]dCTP(400Ci/mmol) 10ul
1mol/L(NH4)2SO4 1.5ul
RNase H(1000 单位/ml) 1ul
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I(10000 单位/ml) 4.5ul
温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机内稍离心，以除去所有气泡。在 16°C 温育 2~4 h。
2. 温育结束，将下列试剂加到反应混合物中；
β-NAD(50 mmol/L) 1ul
大扬杆菌 DNA 连接酶 (1000~4000 单位/ml) 1ul
室温温育 15 min。
3. 温育结束，加入 1ul 含有 4 种 dNTP 的混合物（每种浓度为 10 mmol/L）和 2ul(5 单位）T4 噬菌体 DNA 聚合酶。反应混合物室温温育 15 min。
4. 取出 3ul 反应物。按步骤 7 和步骤 8 描述的方法测定第二链 DNA 的质量。
5. 将 5ul0.5mol/L EDTA(pH8.0) 加入剩余的反应物中，用酚: 氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在 0.3mol/L(pH5.2) 乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收 DNA, 将 DNA 溶解在 90ul TE(pH7.6) 溶液中。
6. 将下述试剂加到 DNA 溶液中：
10XT4 多核苷酸激酶缓冲液 10ul
T4 多核苷酸激酶（3000 单位/ml) 1ul
室温温育 15 min。
7. 测定从上面步骤 4 取出的 3ul 反应物中放射性活度，并按附录 8 所述方法测定 1ul 第二链合成反应产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8. 用下面公式计算第二链反应中所合成的 cDNA 量。要考虑到已掺入到 DNA 第一链中的 dNTP 的量。
这里 x 表示 cDNA 第一链量（来自阶段 1 步骤 6)。DNA 第二链合成量通常为第一链量的 70%~80%。
9. 用等量酚: 氯仿对含有磷酸化 cDNA(来自步骤 6) 的反应物进行抽提。
10.Sephadex G-50 用含有 10mmol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的 dNTP 和 cDNA 分开（见附录 8)。
11. 加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和 2 倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的 cDNA, 将样品置于冰上至少 15 min, 然后在微量离心机中以最大速度 4°C 离心 15 min, 回收沉淀 DNA。用手提微型监测仪检査，是否所有放射性都沉淀下来。
12. 用 70% 乙醇洗涤沉淀物，重复离心。
13. 小心吸出所有液体（检查吸出的液体中是否完全没有放射活性)，空气干燥沉淀物。
14. 如果霈要用 EcoRI 甲基化酶对 cDNA 进行甲基化，可将 cDNA 溶解于 80ul TE(pH7.6) 溶液中（见本方案步骤 3)。另外，如果要将 cDNA 直接与 Not I 或 Sal I 接头或寡核苷酸衔接子相连（见本方案步骤 4), 可将 cDNA 悬浮在 29ulTE(pH7.6) 溶液。
沉淀的 DNA 重新溶解后，尽快进行 cDNA 合成的下一步骤。
在 cDNA 文库构建过程中，需多次采用乙醇沉淀 cDNA。因为 cDNA 量常常非常少（经常非常珍贵)，所以必须特别小心，以求 cDNA 回收比例达到最大。有关这方面建议，见附录 8。
|
|---|
