cDNA 文库的构建（四）
方法
cDNA 末端的削平
1.cDNA样品（来自步骤 11)于 68°C 加热5 min。
这一步骤是使cDNA分子的单链突出端可能形成的双链结构发生变性。
2. 将cDNA溶液冷却至37°C并加入下列试剂：
5xT4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10ul
dNTP溶液, 每种5 mmol/L 5ul
加H20 至50ul
3. 加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml),37°C温育15 min。
4. 加入1ul0.5mol/LEDTA(pH8.0), 以终止反应。
5. 用酚: 氯仿抽提，再通过Sephadex G-5O离心柱层析，除去未掺入的dNTP(见附录8)。
6. 在柱流出液中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2)和二倍体积的乙醇，样品于 4°C至少放置15 min。
7. 在微量离心机上以最大速度离心15 min(4°C)，回收沉淀的cDNA。沉淀经空气干燥后溶于13ul的10 mmol/LTris-HCl(pH8.0)。
接头-衔接子与cDNA的连接
8. 将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中：
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 2ul
800~1000ng的磷酸化接头或衔接子 2ul
T4噬菌体DNA连接酶(105Weiss单位/ml） 1ul
10 mmol/LATP 2ul
混匀后，在16°C温育8~12 h。
采用摩尔数大大过量（>100 倍）的接头是为了确保 cDNA末端与接头相连，而非 cDNA 之间相互连接。
9. 从反应液中吸出 0.5ul 贮存于4°C, 其余反应液于68°C加热 15 min 以灭活连接酶。
接头-衔接子的限制性内切核酸酶消化
如果限制性内切核酸酶的消化对于 cDNA 与载体的连接是必须的，那么需要继续进行步骤 10~12。否则省却步骤 10~12 直接进行步骤13。有关详细信息，请阅读本方案的导言。
10. 在加热后的连接反应中加入：
10x 限制性内切核酸酶缓冲液 20ul
H20 150ul
限制性内切核酸酶 200 单位
0°C 混匀。
对照管：取 2ul 反应液转移至 0.5 ml 的微量离心管中，再加入 100ng 对照 DNA(体积不超过 0.5ul), 可以是线性质粒。也可是经切割的菌体 DNA 制品。DNA 内部应含有所用的特殊的限制性内切核酸酶切位点。
11. 大体积反应和对照反应一并置于 37°C 温育 2 h。
12. 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分析对照样品及在步骤 9 中吸出的 0.5ul 样品。在 1 或 2 条凝胶电泳道中加入质粒或λ噬菌体 DNA 分子质量标准对照。
如果连接反应良好，连接的接头在凝胶底部应呈片状条带。如果限制性内切梭酸酶消化完全，呈片状条带的接头应消失。对照样品中的质粒或λ噬菌体 DNA 应被合理切割。cDNA 与衔接子连接后，cDNA 大小不会有明显改变，所以当使用衔接子时可省去凝胶电泳对样品的分析。用于分级分离的 CDNA 的制备
13. 通过酚：氯仿抽提和乙醇沉淀的方法纯化 cDNA,cDNA 溶于 20ulTE 液中 (pH8.0)。
14. 加入 2.5ul 的 0.25% 溴酚兰溶液（50% 甘油配制），这将会使 cDNA 文库在下一步通过 SepharoseCL-4B(步骤 5) 分级分离时相对简单化。
阶段 5:SepharseCL-4B 凝胶过滤法分离 cDNA
材料
缓冲液和溶液
乙醇
乙酸钠（3 ml/L,pH5.2)
TE(pH7.6)
含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)
Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)
凝胶
琼脂糖凝胶（1%)
见步骤 8。
核酸和寡核苷酸
cDNA
阶段 4 中步骤 13 及 14 制备的 cDNA。
DNA 参照物
DNA 参照物应为末端标记的片断，长度 200bp~5kb。
专用设备
过滤的压缩空气
止血器或软管夹
带有弯头的皮下注射针头
1 ml 无菌吸管
聚乙烯管
剪刀
Sepharose CL-4B
用含有 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 对市售糊状 Sepharose CL-4B 清洗数次。这种清洗可以去除存留在某些批号凝胶中的连接抑制剂。Amershan Pharmacia 生物技术公司提供已经装填好的 Sepharose CL-4B 柱 (Sizesep400 离心柱)。
乙烯基泡沫管
Whatman3 MM 滤纸
方法
Sepharose CL-4B柱的制备
1. 用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1 ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。
2. 将一段无菌的聚氯乙烯软管（通常用于蠕动泵的管型）与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1mol/LNaCl 的TE(PH7.6)溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。
3. 在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，0.1mol/L氯化钠的TE(pH7.6)平衡了的SepharoseCL-B填充于泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。如有必要，可加入更多的SephamseCL-4B, 直至填充基质几乎充满吸管为止。
柱子直径应约为 27x0.3 cm。
4. 将几倍柱床体积的含0.1mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。
依据大小分离回收DNA
5. 用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积50ul或更小)，放开止血钳，使 cDNA进入凝胶。用50ul TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA 的微量离心管，将洗液亦加于柱上。用含0.1mol/LNaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。
重要: 任何时候都不可使柱子流干！
6. 用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管二滴（约60ul), 直至将所有放射性洗脱出柱为止。
7. 用切仑科夫（Cerenkov)计数器测量每管的放射性活性。
8. 从每一管中取出一小份（约以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb)的 DNA片断作标准参照物，通过1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20°C，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。
制备的琼胞糖凝胶应尽可能薄以便加快电泳完成后干燥的过程。
标准DNA参照物中放射性量应是cDNA峰值放射性量的 30%。
9. 电泳后将凝胶移至一张Whatman3 MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器（市售）上干燥。干燥过程前20 min至30 min于 50°C加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥l~2 h。
10. 置-70°C加增感屏对干燥的凝胶继续X射线片曝光。
柱洗脱早期收集的部分，放射性自显影应显示cDNA大小为5~7kb的片状放射性：随后收集的 cDNA越来越小。
11. 在cDNA长度>500bp 的收集管中，加入 0.1 倍体积的3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和二倍体积的乙醇。于 4°C 放置至少 15 min 使cDNA 沉淀，用微量离心机于 4°C 以 12000 g 离心 15 min, 以回收沉淀的 cDNA。
选择分级收集一定要十分谨慎，切不可选取含有痕量小于500bp 的cDNA的收集管。否則，文库中将含有数量很大的短 cDNA 链克隆。
12. 将 DNA 溶于总体积为20ul的 10 mmol/LTris-HCl(pH7.6) 中。
13. 测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于与噬菌体臂相连接的DNA 总量 (有关 cDNA 第二链的计算，参见阶段 2 步骤 8)。
如果一切顺利，10ug poly(A)RMA 至少可产生 250~400ng(可能髙至 3ug) 的长度大于 500bp 的 cDNA。
阶段 6:cDNA 与λ噬菌体臂的连接
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
ATP(10 mmol/L)
SM
酶和缓冲液
噬菌体 T4DNA 连接酶
凝胶
琼脂糖凝胶（1%)
见步骤 8。
核酸和寡核苷酸
cDNA
使用阶段本方案 5 步骤 12 制备的 cDNA。
λ噬菌体 DNA 对照
通常随商品化的包装提取物提供，用以检测提取物的包装效率。
DNA 参照物
DNA 参照物须为 500bp~5kb 之间的片段。
专用设备
预设温度为 16°C 的水浴。
附加试剂
本方案步骤 4 需要的试剂列于第 2 章方案 1。
本方案步骤 7 需要的试剂列于第 2 章方案 23。
载体和菌株
λ噬菌体臂
如果准备要制作大量文库，自行制备噬菌体臂（通过琼脂糖凝胶电泳或蔗糖密度梯度离心，见第 2 章方案 16) 要比购买省钱得多。对偶尔构建文厍的研究者，由于某些载体（如λgt10、λFix 和λZipLox) 的去磷酸化臂可在 Stratagene、Life Technologyies 等公司有商品出售，无论噬菌体臂来源如何，都要进行一系列顼实验以检査臂与外源 DNA 连接效率以及包装成感染的菌体颗粒的效率，这很重要。商品化的载体臂包装中通常含有用于对照试验的 DNA。
大肠杆菌菌株，新鲜制备的过夜培养物在用噬苗体 Xgt10 构建 cDNA 文库时，C600 菌株（BNN93) 用于生长，BNN102(C600 hflA) 用于筛选。
Y1090 hsdR 菌株用于噬菌体λgtll 构建的 cDNA 文库的生长和筛选。BB4 菌株用于λZAP 和λZAPII 构建的 cDNA 文库的生长和筛选。对于λZAPll 构建的文库也可使用 XL1-blue 菌株（XLl-blue 能强有力支持λZAPII 的生长，不支持λZAP 的生长）。参见下面信息栏“λ噬菌体在大肠杆菌菌株上铺板”。
用于λ噬菌体的包装抽提物
制备包装抽提物难度大，应购买商售的。有几家公司提供具有某种特性的包装试剂盒。有关包装抽提物的描述参见信息栏“体外包装”。
方法
1. 按下述方法建立 4 组连接-包装反应：
ATP 以 10x 连接缓冲液组分的方式加入可以使反应体系中留有更大的体积，以便加入更多的载体或外源 DNA。如果使用含有 ATP 的连接缓冲液，就不必另加 ATP。
连接混合物于 16°C 培育 4~16 h。剩余的 cDNA 储存于-20°C。
2. 按包装提取物厂商提供的方法，从每组连接反应物中取 5ul 包装到噬菌体颗粒中。
由于最终 cDNA 文库的大小取决于重组λ噬菌体基因组包装入感染性噬菌体顆粒的效率，所以必须使用能产生大于 5x108pfu/ug λ噬菌体 DNA 的高效包装混合物。
不要忘记要引入对照λDNA(通常由包裝试剂盒提供）以确定提取物的包装效率。
3. 包装反应完成后，在各反应混合物中加入 0.5 mlSM 培养基。
4. 预备适当的大肠杆菌菌株新鲜过夜培养物，包装混合物做 100 倍稀释，各取 10ul 和 100ul 涂扳，于 37°C 或 42°C 培养 8~12 h。（见第 2 章方案 1 和专栏“λ噬菌体在大肠杆菌菌株上铺板”）
5. 计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑，连接反应 A 不应产生重组噬菌斑，而连接反应 B、C 和 D 应产生数目递增的重组噬菌斑。
6. 根据重组噬菌斑的数目，计算 cDNA 的克隆效率（pfu/ng cDNA)。如果一切顺利，效率至少可以达到 2x104pfu/ng cDNA。5ug poly(A)+RNA 产生的重组体总数应超过 5x106。
7. 挑取 12 个重组λ噬菌体空斑，小规模培养裂解物并制备 DNA，以供适当的限制性内切核酸酶消化。
8. 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分析 cDNA 插入物的大小，用长度范围 500bp~5kb 的 DNA 片段作为分子质量参照。
