农杆菌感受态的制备和转化
| 实验方法原理 | 主要原理是通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理，使农杆菌细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。 |
|---|---|
| 实验材料 | 农杆菌 重组质粒 |
| 试剂、试剂盒 | 链霉素 YM液体培养基 CaCl2溶液 甘油 |
| 仪器、耗材 | 离心管 Eppendorf管 冰箱 冷冻离心机 接种环 锥形瓶 |
| 实验步骤 |
一、农杆菌感受态细胞的制备 1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。 2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。 3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃ 220rpm振荡培养至OD600=0.5。 4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。 5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。 6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。 7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。 二、双元载体转化农杆菌EHA105 1. 取1 μg左右的质粒DNA加入到200 ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。 2. 再在37℃水浴5min或42℃水浴1min。 3. 接着冰浴2min，加入800ml YM液体培养基。 4. 28℃，175rpm摇培3 hr后，涂在含50 μg/ml Kanamycin的YM平板上。 5. 28℃培养到形成单菌落。 注：其中 YM 可以用LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。
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