抗磷酸肽的单克隆抗体制备实验
实验方法原理
实验材料 融合后的候选杂交瘤细胞系BSA 交联的同种磷酸肽BSA 交联的同种非磷酸肽BSA 交联的非同种磷酸酪氨酸肽BSA 交联的同源磷酸肽
试剂、试剂盒 筛选稀释液阴性对照（用于制备杂交瘤系的小鼠的免疫前血清）阳性对照（用于制备杂交瘤系的小鼠的免疫后血清）
仪器、耗材 HT 培养基96 孔聚苯乙烯组织培养板网格标记的纸片
实验步骤
1. 将融合后的杂交瘤细胞以低密度（最好是每三个孔有一个细胞）接种到多个 96 孔聚苯乙烯组织培养板中，培养于 HT 培养基中。约 2 周后用 96 格-网格纸片记录克隆数以检查并鉴定出所有的单克隆杂交瘤细胞培养孔。在含有一个克隆的孔下做上标记以便于鉴别。
2. 采用无菌技术从每个潜在的候选孔中吸取部分上清（如从 200 μl 培养液中吸取 100 μl 转移到另一 96 孔聚苯乙烯板（「筛选平板」）中。记录初始培养板的编号和孔的位置以及相应的筛选平板的平板编号和孔的位置（如在代表筛选平板的网格纸片上记录上清液来源的初始平板的编号和孔的位置）。往初始培养板的每个孔中补加 100 μl 37℃ 的新鲜 HT 培养基。
3. 往筛选平板各孔的上清液中加入 150 μl 筛选稀释液。
4. 从筛选平板的每个候选杂交瘤上清液中取一小份（如 50 μl），以同种磷酸肽-BSA 交联物为抗原用 ELISA进行筛选。记录每个阳性样品所对应的筛选平板编号和孔的位置，以及相应的初始培养板的编号及孔的位置。同时检测用于融合的小鼠的免疫前血清（阴性对照）和免疫后血清（阳性对照），将两种血清按照 1:100 稀释于 HT 培养基与筛选稀释液的混合液（1:1）中，然后再进行测量。再包含一个仅含筛选稀释液（额外的阴性对照）的 ELISA。
5. 从步骤 4 中筛选出的阳性样品中取一小份针对同种非磷酸肽- BSA 交联物进行 ELISA 筛选以去除具有不依赖磷酸化反应性的克隆。取一份针对非相关的磷酸酪氨酸肽-BSA 交联物进行 ELISA 筛选以去除对磷酸酪氨酸没有选择性而都能发生反应的克隆。此外，如果预测能与同源磷酸蛋白质有交叉反应，还要进行针对任何可能有交叉反应的同源磷酸蛋白质-BSA 交联物的 ELISA 筛选。
6. 将满足所有筛选条件的克隆进行扩增，分装并部分冻存，其余的通过有限稀释进行亚克隆。
7. 按照步骤 4 和 5 的方法对亚克隆的培养上清液进行筛选以检测抗体的持续产生及其特异性。
8. 为了进一步对亚克隆进行定性并鉴定出最有用的克隆，用各种免疫检测方法（如免疫沉淀法或免疫印迹分析法）测试培养上清液对同种全磷酸蛋白质的反应性。
注意事项
所有会与活细胞接触的溶液和设备都必须是无菌的，并且应当采用正确的无菌操作技术。
