逆转录酶原位 PCR 实验
实验方法原理 原位 PCR 仪，盖玻片，培养箱，湿盒，RT-PCR 试剂盒，Permount
实验材料 组织样品和细胞培养物
试剂、试剂盒 Nuclear Fast Red甲醛缓冲液检测溶液DEPC 处理的水PBSKH2P04二甲苯乙醇牛血清白蛋白SSC NBT BCIP 显色剂胃蛋白酶DNA 酶Taq DNA 聚合酶RNA 酶 inhibitorDNA 酶缓冲液dUTP抗地高辛的偶联物PCR 引物
仪器、耗材 原位 PCR 仪盖玻片培养箱湿盒RT-PCR 试剂盒Permount
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
Nuclear Fast Red
10%(体积分数）甲醛缓冲液 (Polyscientific)
检测溶液（0.1mol/LTris-HCl、pH9.5，0.1mol/LNaCl)
DEPC 处理的水
磷酸盐缓冲液（PBS)(137 mmol/LNaCl，2.7 mmolKCl,10 mmol/LNa2 HPO4)
2 mmol/LKH2P04，pH7.0, 用于细胞培养物
二甲苯（用于组织样品）...
乙醇
牛血清白蛋白（BSA)，20 g/L
SSC，20X(3mol/LNaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠，pH7.0)
NBT/BCIP 显色剂 (EnzoClinicalLabs)
2. 酶和酶缓冲液
胃蛋白酶 (2 mg/ml)(Enzo Diagnostics)
配时加 20 mg 的胃蛋白酶，9.5 mlH2O 和 0.5 ml 2mol/L HCl
无 RNA 酶的 DNA 酶（Boehringer Mannheim)
Taq DNA 聚合酶 Gold(Applied Biosystems，FosterCity,CA)
RNA 酶 inhibitor(Applied Biosystems)
DNA 酶缓冲液，10X
配时加 35ul 的乙酸钠（3mol/L，pH3)、5ulMgS04(lmol/L) 和 60ulDEPC 处理的 H2O。
3. 核酸和寡核苷酸
地高辛标记的 dUTP(Boehringer Mannheim)，1mmol/L
4. 抗体
抗地高辛的偶联物（antidigoxigen inconjugate)(Boehringer Mannheim)
合适的 PCR 引物
5. 专用器材
硅烷化的载破片（Ventana)
原位 PCR 仪（AppliedBiosystems)
聚丙烯薄片（polypropylenesheet)，用来作盖玻片（有高压消毒的袋装市售）
设定为 37°C 和 60°C 的培养箱
湿盒（垫有浸透水的纸巾的有盖的盒子）
6. 其他
RT-PCR 试剂盒（AppliedBiosystems)
这一试剂盒包括 RT-PCR 需要的缓冲液、核苷酸、RNA 酶抑制剂、锰溶液、rTthDNA 聚合酶以及对照引物。
石蜡包埋以及切片所需要的试剂和器材（用于组织祥品）
Permount
7. 细胞和组织
合适的组织样品和细胞培养物
许多试剂包括蛋白酶、缓冲液、洗液、显色剂、探针和复染剂都包含在原位杂交的试剂盒中。现在许多生物公司出售该试剂盒。
二、方法
1. 组织切片和细胞样品的准备
（1）将材料放入 10% 的甲醛缓冲液中固定 8~15 h，然后用石蜡包埋。
（2）如果是细胞培养物，直接将 PBS 加入到培养平板中清洗一次细胞。再加入 10% 的甲醛溶液，固定过夜，然后用乳胶刮刷将细胞从平板上刮下来。将收集的细胞在 DEPC 处理的 H2O 中清洗两次，放入台式离心机中 2000r/min 离心 3 min。将细胞重悬于 5 mlDEPC 处理的 H20 中，取 50ul 滴加在载破片上（最佳浓度：2500~7500 个细胞），风干，室温保存。
（3）取至少 3 份 4um 厚的石蜡组织切片或 3 份细胞悬浮液至硅烷化的载坡片上，并使材料固定在载破片上。
硅烷化处理对细胞黏附是非常必要的。
（4）将组织切片在新鲜的二甲苯中放置 5 min 除去石蜡，然后将其放入 100% 的乙醇，5 min 后取出，风干。
2. 蛋白酶处理
（5）将制好的片子放入胃蛋白酶溶液中，37°C 温育适当时间。
确定蛋白酶孵宵的时间见表 19-1 和表 19-2. 除胃蛋白酶外，其他的蛋白酶也可用作消化处理。详细信息参见 19.2.1.2 蛋白酶消化。
（6）将玻片放入 DEPC 处理的 H20 中 lmin, 以使蛋白酶失活，然后将其放入 100% 的乙醇中 1min, 取出，干燥。
这样简单的清洗步骤就足以除去/灭活胃蛋白酶，不需要加热灭活。
3.DNA 酶处理（适用于逆转录酶原位 PCR)
（7）在 3 张片子的 2 张上加 lul10XDNA 酶缓冲液、lul 无 RNA 酶的 DNA 酶（10U/ul、8ulDEPC 处理的 H20。也可以选用 RT/PCR 的缓冲液代替 10XDNA 酶缓冲液。
（8）按照玻片上样品材料的大小将聚丙烯薄片（polypropylenesheet) 裁成合适的尺寸，盖在所加的溶液上以防止其变干。将破片放入湿盒内，37°C 温育。
（9）消化过夜后，移去盖片，将载坡片放入 DEPC 处理的 H20 中清洗 lmin, 然后放入100% 乙醇中，取出，干燥。
4. 反转录
（10）取一无菌的离心管，加入如下 RT/PCR 的试剂。
EZ 缓冲液（AppliedBiosystems) 10ul
4 种核苷酸（dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP,每种核苷酸的浓度均为 10mmol/L) 各加 1.6ul
牛血清白蛋白（200 g/L) 1.6ul
DEPC 处理的 H20 15.lul
MnCl2(或者乙酸锰）溶液（10 mmol/L) 12.4ul
正义引物（20umol/L) 2.0ul
反义引物（20umol/L) 2.0ul
RNA 酶抑制剂 0.5ul
地高辛标记的 dUTP(1mmol/L) 0.6ul
rTth 2.0ul
（11）将配好的 RT/PCR 的反应溶液加在经过 DNA 酶处理的 2 张破片中的 1 张上。
（12）为了防止变干，用一小滴指甲油将聚丙烯盖片固定在载玻片上，将载玻片放入一个铝「船」(aluminum「boat」）内，并在其上覆盖无菌的矿物油。然后放在热循环仪的模块(block) 上，于 60°C 保温 30 min。
AppliedBiosystcms 公司的 Amplicover/Ampliclip 方法可用来替代矿物油。
5.PCR
（13）将一无菌的离心管置于冰上，加入如下 PCR 反应试剂。
Taq聚合酶缓冲液（AppliedBiosystems) 5ul
dNTP 溶液（每种核苷酸均为 10 mmol/L) 9.0ul
MgCl2,25 mmol/L 8.0ul
牛血清白蛋白，20 g/L 1.6ul
H2O 22.4ul
正义引物（20umol/L) 2.0ul
反义引物（20umol/L) 2.0ul
Taq 聚合酶 Gold(10U/ul) 2.0ul
（14）在每一个样品上都加上 PCR 反应混合物，进行如下热循环反应。
（15）从载玻片上除去盖片和指甲油。在二甲苯中洗 5 min 后放入 100% 的乙醇中 5 min，取出，风干。
6. 检测
（16）将玻片放入含 2 g/LBSA 的 0.2XSSC 中，60°C 洗 15 min(适用于逆转录酶原位PCR)。
对做原位杂交 PCR 而言，如果使用至少 80bp 大小的全长基因组探针，就用上述洗液清洗。如采使用小于 45bp 的寡探针杂交，则用含 20 g/LBSA 的 1XSSC 在 45°C 洗 10min。
（17）除去残余的洗液，每张载玻片加 100ul 含地高辛抗体（按 1:150 稀释）的 0.lmol/L Tris-HCl，pH7,5，0.1mol/LNaCl 溶液。37°C 温育 30 min。
（18）用检测溶液洗玻片 lmin，然后将其转入含有 NBT/BCIP 显色剂的检测溶液中，37°C溫育 5~30 min, 在经销商的使用说明中有详细说明（EnzoClinicalLabs)。如果是直接将标记物掺入到扩增 DNA 中，则温育时间可短些；如果是使用探针检测，则温育时间要求长一些。将载玻片放在显微镜下镜检，当见到强烈的信号时终止反应。对原位杂交 PCR 而言，探针-扩增子复合物应当杂交 15 h; 针对此目的推荐使用地高辛标记的探针。同时，在允许的情况下尽可能地使用最长的探针（最好 80~100bp), 这很重要。由于引物的低聚反应一般不会在原位杂交 PCR 中发生，因此可以使用包含引物区段的全长探针。同样，使用随机延伸的方法标记探针也很重要（Nuovo1997)。如果使用较短的探针，它们不得短于 45bp, 并且要采用 3'末端的方法标记(Nuovo1997)。
（19）将载玻片在水中清洗 1 min，用 nuclearfastred 复染 5 min，再在水中清洗 1 min，然后放入 100% 乙醇中 lmin，二甲苯中 lmin。用 Permount 封片，显微镜下观察。
