RNA 反转录
实验材料 poly(A)+RNA反转录酶鼠源反转酶 或禽源反转录酶
试剂、试剂盒 oligo(dT)12-18 lmol LTris-Cl 1mol LTris-Cl lmol LKC1 25 mmol LMgCl2 dNTP 混合物 0.lmol LDTT RNasin
实验步骤
一材料与设备
1)poly(A)+RNA,lmg/ml
Z)oligo(dT)12-18,lmg/ml
3)lmol/LTris-Cl（pH7.6)。
4)1mol/LTris-Cl(pH8.3)
5)lmol/LKC1
6)25 mmol/LMgCl2
7)dNTP 混合物，各 5 mmol/L
8)0.lmol/LDTT
9)RNasin。
10) 反转录酶，鼠源反转酶 (Pharmacia 公司，200U/ul) 或禽源反转录酶（20U/ul)
二、操作方法
(一) 使用鼠源反转录酶合成 cDNA
1) 在灭菌微量离心管中混合下列物质，并置于冰上:
Poly(A)+4RNA,lmg/ml 10ul
oligo(dT)12-18,lmg/ml 10ul
lmol/LTris-Cl(pH7.6) 2.5ul
lmol/LKC1 3.5ul
250 mmol/LMgCl2 2ul
dNTP 混合物，各 5 mmol/L 10ul
0.lmol/LDTT 2ul
RNasin 25U
鼠源反转录酶 200U
加水至总体积为 50ul
2) 于 37°C 反应 lh
3) 纯化回收. 保存于一 20℃
(二）使用禽源反转录酶合成 cDNA
1) 在火菌微量离心管中混合下列物质，井置于冰上:
poly(A)+RNA,lmg/ml 10ul
oligo(dT)12-18,lmg/ml 10u1
lmol/LTris-Cl(pH8.3) 2.5uI
lmol/LKC1 3.5ul
250 mmol/LMgCI2 2ul
dNTP 混合物，各 3 mmol/L 10ul
0.lmol/LDTT 2ul
RNasin 25U
禽源反转斌酶 40U
加水至总体积为 50ul
2) 于 42℃ 反应 lh
3) 纯化冋收，保存于一 20℃
注意事项
1) 可以先进行小规模的预实验以确定反转录酶的用量。
2) 在反应中加入 [α32P]dCTP，可以通过放射性自显影检测反转录的质量和产率
3) 对于具有不利于转录反应的二级结构的 mRNA 的转录，使用最适温度为 42℃ 的禽源反转录酶可能取得较好的结果。
4）除使用 oligo(dt)12-18 外，在反转录反府中也可以使用长度为 6 的随机寡聚核苷酸。
5) 随若基因芯片技术的发展和逐渐普及应用，产生了由 mRNA 反转彔而获得荧光标记 cDNA 探针的方法。与常用的 RNA 探针同位素标记不同之处就在于其加入了荧光染料 Cy3 或 Cy5 代替了冋位素标记的 dNTP。
