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分子生物学实验小技术

2020.7.27

当找到可能的重组质粒且条带清晰时可直接切下含DNA 的凝胶条带,用胶回收DNA 的方法回收质粒并进行酶切鉴定,如果DNA 量太少则需重提质粒。 QIAprep Miniprep Spin 小量提质粒注意以下事项可提高得率

A.用含抗生素的培养基培养细菌会有较高的得率。

B.收菌时用tips吸干净残余的培养基上清。

C.加入P1后应充分振荡以完全打散悬浮细胞,特别是多次离心收菌的情况下较难打散细菌,可用tips 反复吸打因为残留的小块菌团会严重影响得率和DNA 的质量。

D.加入P2后立即轻轻摇匀,可反复倒转epperdorf 管4-6 次充分混匀菌数较多时可静置不超过5 分钟,以便充分裂解提高得率,超过5 分钟的会降低质粒质量。甚至可能出现部分质粒不可逆的变性的情况,可能在电泳时得到一条酶切不动的质粒条带。

E.加入N3后立即轻轻混匀,可反复倒转epperdorf 管5-7 次以充分混匀。菌数较多时可静置几分钟以便质粒充分复性。

F.离心后上清液上柱,注意不要将悬浮的细胞碎片(如果有的话)加入柱中,如已在柱中请吸出。我们建议一定用PB洗柱,特别是菌数较多,或菌株糖蛋白较多的情况,以保证DNA 的质量。

G.对于较大的质粒,(<10Kb ),请70摄氏度预热、洗脱buffer或ddH2O 以提高得率,对于拷贝数不高的情况可以用50ml洗脱buffer或ddH2O 分别洗2 次,如果拷贝数高的可用100ml.静置1 分钟后再离心,有助提高得率,buffer或H2O 应加在膜中央而非管壁上。




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