分子生物学常用实验技术（八）
第五章重组质粒的连接、转化及筛选
第一节概述
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA
片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA
和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA
的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。外源DNA
片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA
片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA
片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR 扩增时，在DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA
均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA 的浓度,
以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA 的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA
的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA 片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli
受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA
聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA 连接酶的浓度和外源DNA 及载体DNA
浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA 分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA
分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA
片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coliDNA聚合酶Ⅰ的klenow
大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。
本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E.
coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。因pBS
带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA 的转化子才能在含有Amp 的LB
平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。pBS
上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N 端146
个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli
DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS 和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS
和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ
基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+
细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS
质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力,
因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH
下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA
分开。此为α-互补现象筛选。
第二节材料、设备及试剂
一、材料
外源DNA 片段: 自行制备的带限制性末端的DNA 溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS 质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM 系列等具有α-互补能力的菌株。
二、设备
恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台， 微量移液枪，eppendorf 管。
三、试剂
1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L
Tris?Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml
牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L ATP（过滤灭菌）。
2、T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
3、X-gal 储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml 的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
4、IPTG 储液(200mg/ml): 在800μl 蒸馏水中溶解200mg IPTG 后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于eppendorf 管并储于-20℃。
5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g 麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp 储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。
6、含X-gal 和IPTG 的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp 的LB 平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG 储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收。
7、感受态细胞制备试剂: 见第三章。
8、煮沸法快速分离质粒试剂: 见第一章。
9、质粒酶及电泳试剂: 见第二章。
第三节操作步骤
一、连接反应
1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf 管, 编号。
2、将0.1μg 载体DNA 转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA 片段。
3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5 分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。
4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24 小时。
同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA 片段没有质粒载体。
二、E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化
每组连接反应混和物各取2μl 转化E. coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。
三、重组质粒的筛选
1、每组连接反应转化原液取100μl 用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
2、倒置平板于37℃继续培养12-16 小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
3、放于4℃数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做）。不带有pBS
质粒DNA 的细胞,由于无Amp 抗性,不能在含有Amp
的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal
和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和x-gal 和ITPG
培养基上均为白色菌落。
四、酶切鉴定重组质粒
用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml 的5ml
LB 液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA 直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS
质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS 慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。
[注意] 1、DNA 连接酶用量与DNA 片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100 倍。
2、在连接带有粘性末端的DNA 片段时，DNA 浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA 浓度至100-200mg/ml。
3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2 个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA 连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。
5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA 片段（2-5 倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA 和载体连接的机会。
6、麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA 的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。
7、X-gal
是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（
b-galactosidase) 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG
是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ 的表达。
8、在含有X-gal 和IPTG 的筛选培养基上，携带载体DNA 的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4 小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。
思考题
1. 在用质粒载体进行外源DNA 片段克隆时主要应考虑哪些因素？
2. 利用α－互补现象筛选带有插入片段的重组克隆的原理是什么？
第六章基因组DNA 的提取
第一节概述
基因组DNA
的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交(包括RFLP)及PCR
分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA
即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA 则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,
从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA
时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA
长度必须在100kb 以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP 和PCR 分析, DNA 长度可短至50kb,
在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP 片段(20kb 以下),并可保证包含PCR 所扩增的片段(一般2kb
以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提取方法有所不同;
不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,
以获得可用的DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA
时, 应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA
提取的一般方法。
第二节从植物组织提取基因组DNA
一、材料
水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。
二、设备
移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml 离心管（有盖）及5ml
和1.5ml 离心管，弯成钩状的小玻棒。
三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris?Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul 巯基乙醇，加水
至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、RnaseA 母液：配方见第一章。
5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE 缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
四、操作步骤：
（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA 提取
1. 在50ml 离心管中加入20ml 提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60 分钟(时间长,DNA 产量高), 不时摇动。
3. 加入20ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10 分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4. 室温下5000rpm 离心5 分钟。
5. 仔细移取上清液至另一50ml 离心管,加入1 倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA 沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf 中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA 絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE 的离心管中,DNA 很快溶解于TE。
7. 如DNA 不形成絮状沉淀,则可用5000rpm 离心5 分钟, 再将沉淀移入TE 管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15 分钟以上，以帮助溶解。
8. 将DNA 溶液3000rpm 离心5 分钟, 上清液倒入干净的5ml 离心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10 分钟, 除去RNA(RNA 对DNA 的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10. 加入1/10 体积的3mol/L NaAc 及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20 分钟左右,DNA 形成絮状沉淀。
11. 用玻棒捞出DNA 沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12. 将DNA 重溶解于1ml TE, -20 贮存。
13. 取2μl DNA 样品在0.7% Agarose 胶上电泳, 检测DNA 的分子大小。同时取15μl 稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA 含量及质量。
[注意] 5g 样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR 等分析之用。
（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA
1. 取3-5 克嫩叶, 液氮磨成粉状。
2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。
3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。
4. 同本节（一）中步骤3-13 操作。
