从正常人和骨关节炎患者关节软骨分离软骨祖细胞实验1
从人关节软骨中分离软骨祖细胞
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 胰蛋白酶 EDTA:胰蛋白酶（0.05%)和EDTA(0.53 mmol L)PBSA配制胎牛血清牛血清白蛋白（BSA)10μg ml和1 mg ml PBSC配制血清纤连蛋白 10μg m1 PBSC配制 |
| 仪器、耗材 | 尼龙膜40μm筛孔（“细胞滤网”）离心管50ml 带圆锥底部便于细胞离心解剖刀片镊子 2对（1大1小）矿油凝胶（凡士林）克隆环 6 mm微量离心机分离软骨用的锁子甲手套记号笔 |
| 实验步骤 | A.组织收集和细胞分离 (a)无菌条件下，用10号解剖刀片小心从软骨下骨下面解剖软骨（见本方案后的注解1)。将软骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培养皿中。 (b)用镊子和刀片仔细将软骨切成1 mm3小块。 (C)将软骨小块转移至含18 mL链霉蛋白酶消化培养基的普通器皿或离心管中。 (d)置于滚转机37℃处理1 h。 (e)吸出消化液弃之。 (f)加人18 ml胶原酶消化培养基，再次置于滚转机37℃处理1 h。 (g)细胞滤网过滤,， (h)用血细胞计数板进行细胞计数。 (i)加人黏附测定培养基，620g离心10 min进行洗涤，用黏附培养基以2000个细胞/ml密度重悬细胞（4000个细胞）。 B.差异黏附测定 (a)用10μg/ml纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿，4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml BSA。 (b)吸出液体，用含1 mg/ml BSA的PBSC封闭培养皿30min。 (c)加人2 ml培养基重悬的细胞悬液静置20 min。 (d)吸出培养基和未贴壁细胞，置于第二个培养皿中20 min。 (e)向第一个培养皿中加人2 ml生长培养基后置于鮮箱。 (f)从第二个培养皿中吸出培养基和未贴壁细胞至第三个培养皿中。 (g)向第二个培养皿中加人2 ml生长培养基后置于孵箱。 (h)向最后一个培养皿中加人200μl FBS后置于孵箱。 (i)3 h后，用相差显微镜计数最初贴壁的细胞。 (j)培养细胞，至明显可见多于32个细胞的集落（见注解2)，一般需10天。 (k)用以下公式计算集落形成率（GFE): CFF=χ天的集落数/0天贴壁细胞的细胞数 集落扩增 (a)用相差显微镜鉴定多于32个细胞的细胞集落，在培养皿下用记号笔将其画圈标记（见注解4） (b)计数和记录每个集落的细胞数 (C)从Petri培养皿中吸出培养基，用PBSA润洗。 (d)在克隆环上无菌涂抹凡士林，或者使用无菌镊子直接将其浸人凡士林 (e)将克隆环置于集落上（见注解5)，向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液5〜10 min—相差显微镜观察细胞已脱离。 (f)重悬细胞，置于Eppendorf管中，300g离心5min(见注解6) (g)生长培养基洗涤，重复上述离心。 (h)生长培养基稀释，12孔板中每孔接种1个集落。 (i)细胞汇合时接种至3.5cm培养皿(或6孔板），然后再移至较大培养瓶25cm2，75cm2最后为175cm2。 |
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