从人关节软骨中分离软骨祖细胞
试剂和材料：
1.骨关节炎患者行膝盖关节半切开手术时未累及的部分；
2.链霉蛋白酶消化培养基：DMEM/F12（1：1）、5%的F、抗坏血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、庆大霉素（50mg/ml），0.2%（终浓度100μg/ml）、链霉蛋白酶 70U/ml、HEPES 10mmol/L；
3.胶原酶消化培养基：DMEM/F12（1：1）、5%的F、抗坏血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、庆大霉素（50mg/ml），0.2%（终浓度100μg/ml）、Ⅰ型胶原酶 300U/ml、HEPES 10mmol/L；
4.胰蛋白酶/EDTA：胰蛋白酶（0.05%）和EDTA（0.53mmol/L）A配制；
5.C：含1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2的Dulbeccorime磷酸盐缓冲液；
6.A：无Ca2+,Mg2+的Dulbeccorime磷酸盐缓冲液；
7.胎牛血清；
8.牛血清白蛋白（A），10μg/ml和1mg/ml，C配制；
9.血清纤连蛋白，10μg/ml，C配制；
10.尼龙膜，40μm筛网；
11.普通器皿，30ml，或离心管50ml，带圆锥底部便于细胞离心；
12.解剖刀片，10号；
13.解剖刀柄，3号；
14.镊子，2对（1大1小）；
15.矿油凝胶（凡士林）；
16.克隆杯，6mm；
17.分离软骨用的锁子甲手套；
实验方法：
1.组织收集和细胞分离；
（1）无菌条件下，用10号解剖刀片小心从软骨下骨下面解剖软骨。将软骨薄片置于含A的9cm Petri培养皿中；
（2）用镊子和刀片仔细将软骨切成1mm3小块；
（3）将软骨小块转移至含18ml链酶蛋白消化培养基的普通器皿或离心管中；
（4）置于滚转机37℃处理1h；
（5）吸出消化液弃之；
（6）加入18ml胶原酶消化培养基，再次置于滚转机37℃处理1h；
（7）40μm细胞滤网过滤；
（8）用血细胞计数板进行细胞计数；
（9）加入黏附测定培养基，620g离心10min进行洗涤，用黏附培养基以2000个细胞/ml密度重悬细胞（4000个细胞）；
2.差异黏附测定；
（1）用10μg/ml纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿，4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml A；
（2）吸出液体，用含1mg/ml A的C封闭培养皿30min；
（3）加入2ml培养基重悬的细胞悬液静置20min；
（4）吸出培养基和未贴壁细胞，置于第二个培养皿中20min；
（5）向第一个培养皿中加入2ml生长培养基后置于孵箱；
（6）从第二个培养皿中吸出培养基和未贴壁细胞至第三个培养皿中；
（7）向第二个培养皿中加入2ml生长配演技后置于孵箱；
（8）向最后一个培养皿中加入200μl F后置于孵箱；
（9）3h后，用相差显微镜计数最初贴壁的细胞；
（10）培养细胞，至明显可见多于32个细胞的集落，一般需要10天；
3.集落扩增；
（1）用相差显微镜鉴定多于32个细胞的细胞集落，在培养皿下用记号笔将其画圈标记；
（2）计数和记录每个集落的细胞数量；
（3）从Petri培养皿中吸出培养基，用A润洗；
（4）在克隆环上无菌涂抹凡士林，或者使用无菌镊子直接将其浸入凡士林；
（5）将克隆环置于集落上，向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液，静置5—10mimdashmdash;相差显微镜观察细胞已脱落；
（6）重悬细胞，置于Eendorf管中，300g离心5min；
（7）生长培养基洗涤，重复上述离心；
（8）生长培养基稀释，12孔板中每孔接种1个集落；
（9）细胞汇合时，接种至3.5cm培养皿（或6孔板），然后再移至较大培养瓶。
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项目成果
