逆转录PCR两步法（RT-PCR）试剂盒使用说明
主要用途
逆转录PCR两步法（RT-PCR）试剂是一种旨在通过逆转录酶（reverse
transcriptase）的作用把RNA逆转录成cDNA后，采用体外扩增DNA的方法（PCR法），进行分析RNA构造的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于RNA分析、cDNA克隆、RNA表达等。尤其可用于低拷贝量的RNA样品。产品即到即用，性能稳定，严格无核酶污染，操作简便，逆转录效率和扩增产量皆高，重复性好。
技术背景
单链DNA结合蛋白（Single-Stranded DNA Binding Protein；SSB）用于改善逆转录酶（reverse
transcriptase）的反应产物和作用效率。超能逆转录酶（Super reverse
transcriptase）是一种DNA聚合酶，用于合成以单链RNA为模板的配对性DNA，并能最大限度地增加第一条链的cDNA的产量。RNA核酸酶抑制剂（RNAsin）具有广谱稳定的RNA酶抑制功能，用于高质量清除RNA酶污染。
产品内容
引导液（Reagent A） 90微升
逆转液（Reagent B） 162微升
反应液（Reagent C） 600微升
补充液（Reagent D） 2毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；有效保证6月
用户自备
RNA样品：用于逆转录扩增的模板
PCR引物：用于逆转录的启动DNA片段
干式恒温仪：用于逆转录反应的孵育
0.5毫升PCR管：用于逆转录和PCR反应的容器
涡旋震荡仪：用于反应物混匀
微型台式离心机：用于样品操作
PCR扩增仪：用于核酸产物扩增
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的引导液（Reagent A）、逆转液（Reagent B）、反应液（Reagent C）和补充液（Reagent D），以及用户自备的RNA样品和引物置入冰槽里融化；同时将干式恒温仪分别设置到70℃和37℃。然后进行下列操作。
第一步：cDNA合成
分别将融化的试剂盒里的试剂溶液涡旋震荡2秒
放进微型台式离心机瞬时离心5秒
移出4.5微升引导液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管
加入8微升用户自备的RNA样品（5微克总RNA或0.25微克POLY A+ RNA）
用枪头混匀
放进70℃干式恒温仪孵育3分钟
即刻放进冰槽里
加入8微升逆转液（Reagent B）
用枪头混匀
放进微型台式离心机瞬时离心5秒
放进37℃干式恒温仪孵育60分钟
即刻放进冰槽里
加入80微升补充液（Reagent D）稀释，混匀
置入冰槽里备用或放进－20℃冰箱里保存
第二步：cDNA扩增
移出30微升反应液（Reagent C）到新的0.5毫升PCR管
加入用户自备的引物F和R（分别总量为350纳克）
加入2微升上述稀释的cDNA合成物
最后加入补充液（Reagent D）到总量50微升，混匀
放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒
使用1000微升枪头加入2滴矿物油（注意：参见注意事项6）
放进PCR扩增仪，PCR反应程序为：
温度（℃） | 时间 | 循环 |
95 | 2分钟 | 1 |
95 Tm用户设定温度（50－62） 70 | 30秒 1分钟 30秒 |
35 |
70 | 5分钟 | 1 |
PCR产物置于－20℃冰箱里保存，直到进行任何后续实验
进行琼脂糖凝胶电泳分析
注意事项
本产品为20次操作
整个操作须在4℃状态下进行
避免反复冻融
整个操作须戴手套，建议使用滤芯枪头，并格外小心，防止降解RNA
建议所有的操作用品属于RNA专用
建议使用5微克总RNA样品量；为了确保获得满意效果，不要低于500纳克
根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）
根据Tm=4（G+C）+2（A+T）公式确定Tm温度；建议使用分析软件
本公司提供系列RT－PCR产品
