去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌中的应用
表观遗传修饰如m6A甲基化在肿 瘤的发生和发展中起到重要作用。而甲基化酶对ai症的影响也受到广 泛关注。其中去甲基化酶ALKBH5已被报道过能通过维持乳腺ai细胞的干细胞性而促进肿 瘤的形成，还有文章探究过其在急性白血病中的作用，但其对胰腺ai的影响还缺乏研究。今年5月份发表在Molecular Cancer (IF=15) 上的文章RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner揭示了去甲基化酶ALKBH5通过调控m6A修饰调节PER1的转录后激 活，发挥对胰腺ai抑 制作用。
RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：15.302
发表时间：2020.5.19
实验方法: m6A-seq, RNA-seq,MeRIP-qPCR, ChIP, CoIP, 双荧光素酶实验
文章链接：RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner
研究内容
1.ALKBH5降低对胰腺ai的指示意义
首先为了探究去甲基化酶ALKBH5在胰腺ai中的表达和临床意义，作者对42个胰腺ai患者的肿 瘤和临近组织做了qPCR和免疫染色，发现肿 瘤中ALKBH5的表达明显降低，mRNA的m6A水平升高。加上对数据库中177个胰腺ai患者生存率的分析发现 ALKBH5低表达与总生存率的降低具有相关性。这些结果初步显示了ALKBH5表达对胰腺ai的预测和预后具有指示意义。
ALKBH5降低对胰腺ai的指示意义
2.ALKBH5降低对胰腺ai细胞转录组水平的影响
接着，作者对3个过表达ALKBH5的胰腺ai细胞样品和3个对照胰腺ai细胞样品进行了RNA-seq（云序提供服务），发现过表达的ALKBH5的细胞中，前15个上调基因包括了 PER1, FOXO1, CDC20, 和CCR5等，GO分析显示上调的基因富集在细胞周期终止、抗增殖和细胞凋亡等功能，而下调的基因富集在细胞增殖和存活相关功能条目中，KEGG分析显示富集的通路中含有细胞周期和生长的相关的通路p53信号通路和 PI3K-AKT信号通路。这些转录组数据显示ALKBH5具有抑 制胰腺ai的功能。
ALKBH5降低对胰腺ai细胞转录组水平的影响
3.ALKBH5抑 制胰腺ai细胞增殖、迁移和侵袭
作者通过细胞表型实验进一步验证ALKBH5对胰腺ai细胞的影响。通过转染手段，发现对胰腺ai细胞进行ALKBH5过表达能导致细胞增值降低，而敲降ALKBH5会导致细胞增值速率上升。细胞群落形成实验和流式细胞仪分析显示了相同结果。并且过表达ALKBH5抑 制伤口闭合和ai细胞侵袭能力。
ALKBH5抑 制胰腺ai细胞增殖、迁移和侵袭
4.ALKBH5抑 制胰腺ai细胞生长和转移
将过表达ALKBH5的ai细胞移植到裸鼠体内，发现过表达ALKBH5的ai细胞生成的肿 瘤体积明显小于对照组，并且细胞生长的指示分子Ki-67的表达也明显降低。染色显示过表达ALKBH5的组织中侵袭和转移的指示分子MMP-2和MMP-9表达降低，敲降ALKBH5的组织中两分子则升高。原位和异种移植模型中都得到了相似的结果。
ALKBH5抑 制胰腺ai细胞生长和转移
5.ALKBH5作用于PER1调控胰腺ai细胞
作者通过ELISA发现过表达ALKBH5的细胞中m6A整体水平下降。于是通过m6A-seq（云序提供服务）进一步寻找去甲基化酶可能作用的靶基因。比较过表达ALKBH5的细胞，对照细胞中发现了7226个特有的甲基化位点，其中应含有ALKBH5作用的基因。通过对RNA-seq和m6A-seq（云序提供服务）两组学联合分析，筛选出78个表达和甲基化水平都明显差异的基因，再与7226个对照组特有甲基化位点所在的基因取交集， 筛选出9个基因。再结合可视化，锁定了3’UTR区有明显m6A峰的基因PER1。
ALKBH5作用于PER1调控胰腺ai细胞
6.缺少ALKBH5引发m6A识别蛋白YTHDF2诱导的mRNA降解，导致PER1的mRNA水平降低
qPCR显示ALKBH5过表达细胞中PER1表达升高，ALKBH5敲降细胞中PER1表达降低, 表明ALKBH5可调控PER1表达。MeRIP-qPCR（云序提供服务）则验证了过表达ALKBH5降低PER1的m6A水平。双荧光素酶实验（云序提供服务）进一步验证了ALKBH5作用在mRNA上的motif序列并能调控PER1的表达水平。另外由于PER1 mRNA上m6A位点与识别蛋白YTHDF2的结合位点临近，作者进行了敲降实验，发现敲降YTHDF2也能导致PER1 mRNA水平升高。这些结果表明，ALKBH5的敲降，导致PER1 mRNA的m6A水平升高，进而被YTHDF2识别增强了mRNA降解。
缺少ALKBH5引发m6A识别蛋白YTHDF2诱导的mRNA降解，导致PER1的mRNA水平降低
7.PER1抑 制胰腺ai细胞
为了验证PER1对胰腺ai的影响，作者首先通过qPCR验证了42个患者的肿 瘤组织中PER1表达降低。生存分析显示PER1低表达和总生存率的降低有相关性，并且对TCGA数据库数据的分析表明PER1表达与ALKBH5水平正相关。CCK-8, EdU 和 transwell实验验证了PER1异位表达可抑 制胰腺ai进展，并部分缓解ALKBH5敲降带来的细胞增值和侵袭。另外，作者还发现了回补PER1表达导致 ATM依赖信号通路的重激 活，包括p-ATM, p-CHK2, p-CDC25C, p-P53, P21,和p-CDK表达的上升。CoIP（云序提供服务）实验也验证了ATM和PER1的相互作用。
PER1抑 制胰腺ai细胞
8.PER1诱导恢复P53表达增强ALKBH5转录
作者发现PER1过表达引起P53升高后，ALKBH5水平也随之升高，同时免疫染色也显示整体m6A水平降低。于是为了验证P53和ALKBH5的关系，通过ChIP实验和双荧光素酶实验（云序提供服务），验证了P53与ALKBH5的启动子区结合，激 活ALKBH5的转录。
PER1诱导恢复P53表达增强ALKBH5转录
总结
本文作者通过RNA-seq, m6A-seq, MeRIP-qPCR, ChIP, CoIP,双荧光素酶实验等方法，研究发现去甲基化酶ALKBH5缺失会加重胰腺ai的发生和不良临床病理表现特征。ALKBH5的过度表达可降低了体外肿 瘤的增殖、迁移和侵袭活性，改善了体内肿 瘤生长，而ALKBH5基因敲除可促进胰腺ai的进展。其调控机制为，ALKBH5调控m6A去甲基化，减少YTHDF2识别m6A导致的mRNA降解，从而在转录后水平上激 活PER1，PER1上调导致ATM-CHK2-P53/CDC25C信号的激 活，抑 制细胞生长。而P53诱导的ALKBH5转录激 活又是对m6A修饰的反馈调节。本研究为基于去甲基化的胰腺ai诊断和治 疗方法提供了基础。
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