去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌中的应用（二）
4.ALKBH5抑 制胰腺ai细胞生长和转移
将过表达ALKBH5的ai细胞移植到裸鼠体内，发现过表达ALKBH5的ai细胞生成的肿
瘤体积明显小于对照组，并且细胞生长的指示分子Ki-67的表达也明显降低。染色显示过表达ALKBH5的组织中侵袭和转移的指示分子MMP-2和MMP-9表达降低，敲降ALKBH5的组织中两分子则升高。原位和异种移植模型中都得到了相似的结果。
5.ALKBH5作用于PER1调控胰腺ai细胞
作者通过ELISA发现过表达ALKBH5的细胞中m6A整体水平下降。于是通过m6A-seq（云序提供服务）进一步寻找去甲基化酶可能作用的靶基因。比较过表达ALKBH5的细胞，对照细胞中发现了7226个特有的甲基化位点，其中应含有ALKBH5作用的基因。通过对RNA-seq和m6A-seq（云序提供服务）两组学联合分析，筛选出78个表达和甲基化水平都明显差异的基因，再与7226个对照组特有甲基化位点所在的基因取交集， 筛选出9个基因。再结合可视化，锁定了3’UTR区有明显m6A峰的基因PER1。
6.缺少ALKBH5引发m6A识别蛋白YTHDF2诱导的mRNA降解，导致PER1的mRNA水平降低
qPCR显示ALKBH5过表达细胞中PER1表达升高，ALKBH5敲降细胞中PER1表达降低, 表明ALKBH5可调控PER1表达。MeRIP-qPCR（云序提供服务）则验证了过表达ALKBH5降低PER1的m6A水平。双荧光素酶实验（云序提供服务）进一步验证了ALKBH5作用在mRNA上的motif序列并能调控PER1的表达水平。另外由于PER1
mRNA上m6A位点与识别蛋白YTHDF2的结合位点临近，作者进行了敲降实验，发现敲降YTHDF2也能导致PER1
mRNA水平升高。这些结果表明，ALKBH5的敲降，导致PER1 mRNA的m6A水平升高，进而被YTHDF2识别增强了mRNA降解。
7.PER1抑 制胰腺ai细胞
为了验证PER1对胰腺ai的影响，作者首先通过qPCR验证了42个患者的肿
瘤组织中PER1表达降低。生存分析显示PER1低表达和总生存率的降低有相关性，并且对TCGA数据库数据的分析表明PER1表达与ALKBH5水平正相关。CCK-8,
EdU 和 transwell实验验证了PER1异位表达可抑
制胰腺ai进展，并部分缓解ALKBH5敲降带来的细胞增值和侵袭。另外，作者还发现了回补PER1表达导致 ATM依赖信号通路的重激
活，包括p-ATM, p-CHK2, p-CDC25C, p-P53, P21,和p-CDK表达的上升。CoIP（云序提供服务）实验也验证了ATM和PER1的相互作用。
8.PER1诱导恢复P53表达增强ALKBH5转录
作者发现PER1过表达引起P53升高后，ALKBH5水平也随之升高，同时免疫染色也显示整体m6A水平降低。于是为了验证P53和ALKBH5的关系，通过ChIP实验和双荧光素酶实验（云序提供服务），验证了P53与ALKBH5的启动子区结合，激 活ALKBH5的转录。
