NACIA数字PCR引物探针设计——Gene-π课堂
NACIA数字PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同：普通PCR的目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格；而数字PCR引物跟real-time PCR引物一样对非特异性反应和引物二聚体要求严格。
NACIA数字PCR引物及探针设计的总体原则
v 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
v 所选列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段。
v 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在50-150bp内。
v 保持GC含量在30%~80%之间。
v 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）。
v 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发夹结构的形成。
v 一些需额外考虑的因素：
☆ 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 。
☆ 如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
☆ 尽量避免Dimer（二聚体）配对区域在3’末端。
☆ 尽量避免3’末端连续几个碱基错配形成False priming（错配）
☆ 衡量二级结构的稳定性
如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应
尽量保证自由能的绝对值<10（可选）
为了避免基因表达过程中检测到DNA，设计应尽量跨内含子区，这可确保扩增的产品只能使用mRNA作为模板。
数字PCR
数字PCR
NACIA数字PCR引物设计基本原则
☆ 扩增片段长度：50-150个碱基
☆ 引物长度：18-24个碱基（20个碱基最优）
☆ Tm值：58℃到 60℃，引物之间的TM相差避免超过2℃
☆ GC含量：30%到80%
☆ 3’端的最后5个碱基内不应有超过2个G+C
☆ 尽量避免重复的核苷酸序列，尤其是不能有4个连续的G
☆ 探针位置尽可能地靠近上游引物，但不能重叠
NACIA数字PCR探针设计基本原则
☆ 探针长度：13-25个碱基（MGB探针）；13-30个碱基（普通Taqman探针）
☆ Tm值：68 °C 到 70 °C(PrimerExpress 计算结果)；通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃）
☆ GC含量：30%到80%
☆ 5’端第一个碱基不能为G
☆ 尽量避免重复的核苷酸序列，尤其是不能有4个连续的G ；避免6个连续的A出现
☆ 对于MGB探针，尽量避免在探针的中部出现2个或2个以上连续的C,3'端的碱基应避免为“GGG”或“GGAG”
☆ 对于FAM 标记的探针，5’端的第二个碱基不能为G
☆ 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量
NACIA数字PCR探针荧光标记物选择:
NACIA数字PCR
NACIA数字PCR多重探针设计原则
☆ 所有靶基因的引物或探针的Tm 值要相接近，引物的Tm 值建议在55-60℃，探针的Tm 值高于引物Tm 值5-10℃。
☆ 不同靶基因的探针标记不同的荧光基团，比如FAM、HEX或CY5，并且要选择发射波长之间渗透最小的荧光报告基团，
☆ 同时要与数字PCR 系统的荧光检测通道参数兼容。
NACIA数字PCR
-
仪器推荐
询底价 Tel：400-6699-117 转 9566 -
仪器推荐
-
仪器推荐
-
仪器推荐
-
仪器推荐
