RT-PCR技术-1
目前已有多种方法用来研究有关细胞和组织中，基因表达产物方面的内容，这些方法主要有Northern印迹、RNase保护分析法、原位杂交、点印迹、Ｓ１核酸酶分析法及反转录与PCR扩增串联的RT-PCR技术等。在这些方法中RT-PCR技术具敏感度高和应用范围广的特点，该技术提供给研究人员有效的进行测定转录产物存在与否、评估基因表达水平等方面的工作,并在不需要构建和筛选cDNA文库的前提下，完成对cDNA片段的克隆。利用RT－PCR技术分离目的基因是目前基因操作中最有效的途径，RT－PCR扩增产物经纯化、回收、与载体重组克窿，即可实现基因的分离。
RT-PCR可由总RNA或mRNA作为模板，该技术目前有多种操作方法
一:两步法：
(一)MMLV、MuLV(莫洛尼鼠反转录酶)，AMV(鸟成骨髓细胞性白血病毒反转录酶)/Ｔaq酶系统:在此系统中，先有反转录酶合成cDNA第一条链,随后灭活反转录酶,有Taq酶合成cDNA第二条链和进行PCR扩增。
(二)TthDNA聚合酶/Mn,Mg离子系统。在此系统中，TthDNA聚合酶在不同离子缓冲液中表现为不同酶性质，在Mn离子缓冲液中，该酶表现为反转录酶性质，而在Mg离子缓冲液中又表现为聚合酶性质。因此操作中，先使系统处于Mn离子状态，有TthDNA酶反转录出cDNA第一条链，随后加入EGTA[乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸]鏊合Mn(因Mn的存在将抑制TthDNA
酶的聚合酶性质的发挥)，再将系统调整到Mg离子状态，有TthDNA酶合成cDNA第二条链及PCR扩增。
二：一步法：
(一)TthDNA聚合酶/Ｎ－二(羟乙基)甘氨酸系统。在此系统中，Ｎ－二(羟乙基)甘氨酸的存在时，Mn离子将不具有抑制聚合酶的聚合活性，因此该酶不需用在中途添加任何试剂到反应系统中，而完成cDNA第一条链－cDNA第二条链－PCR扩增的全过程，但Mn离子的存在虽不会抑制聚合酶活性，且会降低核苷酸渗入的忠实性，因此在要求高度忠实性的实验中,不主张使用该系统。
(二)AMV/Tfl系统。在此系统中cDNA的第一条链的合成有AMV反转录而成，而cDNA第二链的合成及随后的PCR则有Tfl聚合酶催化而成。
下面我们就分别介绍二步法中的MMLV/Taq系统及一步法中的AMV/Tfl系统的详细操作过程。
MMLV/Taq系统进行RT-PCR（二步法）
一：仪器PCR仪、离心机、取液器、电泳仪 、电泳槽 、紫外观测仪
二：试剂PCR试剂、Taq酶、dNTP、DDT、RNA酶抑制剂
10×缓冲液 500 mMKCL100 mMTris-HCL (pH 8.3室温)
15 mMMgCL 0.1% 明胶
三：操作
１：总RNA及mRNA的提取见http://shiyan.ebioe.com/TotalRNAIsolation.htm
２：cDNA第一条链的合成
（1）变性及褪火
（m）RNA 1-2μg
特异引物(100μg/ml) １μl
补水至10ul
90℃ 1min，50℃ 5min,冰浴
（2）：上述管中按下表加入各反应成分
１０×扩增缓冲液 ２μl
４种dNTP混合液 ２μl
50mM MgCL2 1μl
DTT 1ul
RNA酶抑制剂 ２０单位
MMLV 200单位
加水至 20μl
（2）：３７－42℃反应３０分钟
（3）：于９５℃加热５分钟，灭活反转录酶
3：PCR扩增
按下表加入：
１0×扩增缓冲液 5ul
dNTP 2ul
上游寡核苷酸引物 10-50pmol
下游寡核苷酸引物 10-50pmol
Taq聚合酶 2.5u
加上至总体积 50μl
加矿物油 50μl
4：设定参数，PCR扩增
AMV/Tfl系统（一步法）
在本系统中一个反应管、二种酶系统为分析RNA尤其是衡量RNA提供了灵敏度高、快捷便利、可重复性强的方法。由AMV催化cDNA第一链的反转合成;Tfl催化合成cDNA的第二链及进行PCR的扩增反应。该系统提供单一的反应缓冲液体系,而不需要在RNA反转和PCR扩增之间添加其他缓冲液。这样既简化了操作步骤,又降低了RNA模板被污染的可能性。另外该系统的操作中,AMV的反转温度为48℃,这又在最大程度上防止了RNA二级结构的形成。
一:仪器：同上
二：试剂：
1：同上
2：Access RT-PCR试剂盒
