DNA重组（DNA recombination）技术：DNA序列测定-2
目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。
除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）等。
一、双脱氧末端终止法测序
㈠ 原理
双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-17），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构
㈡ 模板
有两种类型的DNA模板可以作为Sanger法测序的模板，即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA。
1．单链DNA模板
在一般情况下，可将靶DNA片段克隆于M13mp载体，从重组克隆M13mp系列噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板。这种单链模板效果最佳，只要细心掌握模板与引物的最佳比例，有经验的测序人员通过一次末端终止反应，能读取500个以上的核苷酸序列。
2．经热变性或碱变性的双链DNA模板
尽管采用变性双链DNA作测序模板显然简单且方便，但实际上很难获得单链模板那样的满意结果。利用双链质粒模板测序，其中有两个至关重要的因素，即模板的质量和聚合酶的种类。用小量制备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆往往因为有污染而并不可取，高纯度的质粒最好采用氯化铯-溴乙锭梯度平衡超速离心法制备。其次是应采用高质量的聚合酶。一次末端终止反应亦可能读出300核苷酸序列。应该注意的是，适合做双链模板的质粒，最好具有较高的拷贝数并有插入失活的选择标志，有配套的通用引物结合区。最常用的载体系统是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。双链模板测序最大的优势是对已知序列DNA的亚克隆进行鉴定，可省略再经M13载体亚克隆获取单链模板过程。
㈢ 引物
酶法测序反应中都有一个与模板链特定序列互补的合成的寡核苷酸作为DNA合成的引物。不管是将靶DNA片段克隆于M13mp载体获取的单链DNA作模板，还是采用变性双链DNA（如变性质粒DNA）模板，都有可以与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物（universal
primer）可用，而不必另行设计与未知DNA序列互补的引物。适合于M13mp系列载体的通用引物一般长15~29个核苷酸，当然这些引物也同样适用于那些克隆于pUC系列质粒的DNA进行双链测序。这些测序用的通用质粒及其通用引物可直接从许多厂商购买到。
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