BHA、BHT、PG混合使用时的测定方法
目前国内的一些食品厂，近年来，有的将三种或其中的两种，分别用
于高油脂的食品中如饼干、巧克力、奶糖、花生米、核桃仁罐头
等BHA、BHT、PG混合使用时BHA与 BHT的总量不得超过0.1g/kg，
即100mg/kg, 而 PG不得超过50mg/kg。本法是用石油醚将食品中的三种抗氧化剂萃取出来，然后从萃取液中萃取PG，再经硅胶柱层析将BHA,BHT分离。
1.原理：抗氧化剂与福林---酚试剂结合，生成一种兰色络合物，所生成的颜色深浅与抗氧化剂的浓度成正比，可比色定量。
2.试剂：a.石油醚30-60℃;b.10%碳酸钠; c.无水乙醇; d. 硅胶，柱层析用，60目; e.福林---酚试剂：称钼酸钠25g→加入85%磷酸50ml，浓盐酸100ml，水700ml，回流加热10小时，然后加入硫酸锂150g，水50ml，溴数滴，煮沸15分钟，最后加水稀释到1000ml,使用时用水稀释三倍; f.抗氧化剂标液：称PG、BHA、BHT各100微克，用80%乙醇溶液溶解后定容100ml(棕色瓶)→冰箱中保存即1000微克/毫升。
3.操作方法
1) BHT的提纯方法：取一层层析柱，按规定装填好，先用石油醚润湿，将上面提纯的PG后分液漏斗内剩余的石油醚层（BHT与BHA的混合液，）全部注入层析柱，用石油醚淋洗，收集150ml淋洗掖作为BHT检查液;
2) BHT的提纯方法：根据层析柱内淋洗液基本流尽，再用无水乙醇淋洗，收集100ml淋洗液，供BHA检验液。
3）显色：吸取PG检验液5ml于10 ml比色管中，取BHT与BHA各5 ml分别于蒸发皿中，在暗室中自然风干，然后在PG、BHA、BHT被检液中各加入10%碳酸钠0.5ml混匀后，各加入0.5ml福林---酚试剂，用水稀释到总体积6 ml放2小时后显色，在730nm下测定E.。4)标准曲线的绘制
准确吸取不同浓度的抗氧化剂标液于10ml比色管中。
10ml比色管 1 2 3 4 5 6
标液10μg/ml 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
10%碳酸钠 ———→0.5ml←——————
水 ———→4ml←——————
福林---酚试剂 ———→0.5ml←——————
加水 ———→至总体积6ml←——————
放两小时比色（730nm测定PG、BHA、BHT的E）,绘制标准曲线。
4.计算：根据测的样品的溶液的光密度，从标准曲线上分别查出对应的PG、BHA、BHT含量（微克/毫升）。
抗氧化剂（mg/Kg）= V/W*V2/V1*C/V3*1000/1000
C-----从标准曲线上查得的PG,BHA,BHT的浓度（微克/毫升）
V-----样品定容得体积（ml）
V1 ---PG、BHA、BHT分离时的体积（ml）
V2---PG、BHA或BHT分离后的每种的定容体积（ml）
V3----显色时取样液得体积 （ml）
W-----样品重量（g）
1000---将μg换算成 mg
1000----表示单位（将g换成Kg）
5.注意事项：
⑴抗氧化剂BHT稳定性较差、易受阳光、热的影响，操作时应避光。
⑵抗氧化剂本身会被氧化，应尽快分析，避免误差。
⑶层析柱的大小，吸附颗粒的范围，吸附剂的多少，装填的高度都对分离有影响，必须严格控制条件。
