条件性恐惧实验-毛冬青改善血管性痴呆小鼠学...（二）
1.6样本采集
恐惧实验结束2h后，每组随机选取6只小鼠，腹腔注射3.5%水合氯醛（10 mL/kg}麻醉，通过心脏灌注4%多聚甲醛固定脑组织，灌注完成后，取脑组织置于10%中性福尔马林溶液中固定，用于病理切片制作。其余小鼠断头处死，迅速摘取大脑，分离海马区，用于免疫组化及W estenl Blot检测。
1.7HE染色观察
固定好的脑组织经修整、脱水、包埋、切片、HE染色、封片等程序后，使用光学显微镜观察小鼠海马组织CA 1区组织结构的变化。
1.8免疫组化检测
Bcl-2, Bax蛋白的分布及表达用T issue 0 C T-Freeze Medium包埋小鼠大脑并制作冰冻切片。严格按照SA B C免疫组化染色试剂盒说明依次固定、封闭、一抗孵育、二抗孵育、SA B C孵育、DAB显色、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜观察，并用数码医学图像分析系统进行数码照相及图片分析Bcl-2, Bax蛋白的分布及表达情况。
1.9Western Blot法检测Bcl-2, Bax蛋白的表达
分离小鼠大脑海马区组织，提取总蛋白，BCA试剂盒进行定量。取50 ug蛋白样本，用15%的聚丙烯酞氨凝胶进行电泳80 V , 20 m in，之后转换为120V、80 min;然后采用湿转法进行转膜300 m A、1 h;TB ST洗膜10 m in , 3次;5 % B SA常温封闭 4 h;4 0C孵育一抗过夜;TBST洗膜10 m in , 3次;37 0C孵育二抗1 h; TBST洗膜10 m in , 3次;ECL进行发光，用ltu age L ab 3.0软件对W estenl B lot成像图进行分析，计算各组蛋白与内参(p-actin)的相对表达值。
1.10统计学处理方法
采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以x士s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者使用LSD检验;方差不齐者使用D unnett' s检验。
2结果
2.1各组小鼠爬杆评分比较 爬杆实验用于评价各组间小鼠肢体协调能力的差异。评分结果显示:假手术组、模型组及各给药组间均无明显差异(P > 0.05 )，表明本研究采用的VD造模方法对小鼠的运动及平衡能力没有造成影响，见表1 ;
2.2PHRE对小鼠条件恐惧记忆的影响 与假手术组比较，模型组小鼠的僵直时间百分比显著缩短((P<0.09，表明VD模型复制成功，小鼠的记忆能力下降。与模型组比较，尼莫地平组及PH
R E中、高剂量组小鼠的僵直时间百分比明显延长，差异具有统计学意义(P<0.09，表明PH R E在10-20
g/kg范围内对VD小鼠的记忆能力有明显的改善作用，见图1
2.3毛冬青提取物对VD小鼠大脑神经元细胞形态的影响
病理组织学检查显示，假手术组小鼠大脑皮层和海马区神经细胞的形态及分布未见异常。与假手术组比较，模型组小鼠神经细胞间质水肿，细胞核浓染、固缩，皮层神经细胞明显减少，且伴有大量胶质细胞增生，多处聚集成堆，大脑海马CA
1区的锥体细胞大量缺失、变性、坏死，齿状回颗粒细胞变性成空泡样。与模型组比较，PH R
E低、中、高剂量组和尼莫地平组小鼠的大脑神经元病变情况有明显改善，体现为胶质细胞增生减少，海马CA 1区锥体细胞病变程度明显减轻，见图2 ;
2.4免疫组化法检测
VD小鼠海马CA1区凋亡蛋白Bcl-2, Bax的分布和表达结果显示，Bcl-2,
Bax呈不连续的环状或者片状分布，主要在胞质表达。与假手术组比较，模型组的Bc}2和B ax蛋白表达明显增加。与模型组比较，尼莫地平组及PH R
E中、高剂量组的Bcl-2表达增加，B ax表达减少。表明VD模型小鼠的海马CA1区神经元细胞发生凋亡，而在尼莫地平或PH R
E的干预下，凋亡现象减少，提示毛冬青提取物可以减少VD模型小鼠的海马CA1区神经元凋亡的发生。见图3- 5;
2.5 Western Blot法检测VD小鼠海马区Bcl -2 ,Bax蛋白的表达 Bcl -2水平的升高和B ax蛋白的降低表明细胞对凋亡的抵抗性增强，是药物起保护作用的标志。Bcl -2 ,Bax的比值越大，则抗凋亡能力越强。结果显示，与模型组比较，毛冬青提取物能提高VD小鼠海马区Bc}2蛋白的表达水平，同时降低B ax蛋白的表达，即明显升高Bcl -2 ,Bax的比值，表明毛冬青提取物可以提高VD小鼠海马区细胞的抗凋亡能力，从而对VD小鼠海马区的神经元起保护作用。见图6 ;
3讨论
本研究通过血流阻断联合放血法复制小鼠VD模型，经过小鼠智能测试及病理学检查证实模型制备成功。实验结果表明，VD模型组小鼠恐惧记忆时间缩短，且脑部海马CA 1区神经元发生损伤，而毛冬青提取物能够明显提高VD小鼠的恐惧记忆时间，降低VD小鼠神经元细胞损伤的程度，结合其对凋亡蛋白Bcl -2 ,Bax的影响可以推断，毛冬青通过抑制海马CA1区的细胞凋亡而发挥神经保护作用。
大脑海马区损伤会引起血管性痴呆，从而导致认知功能障碍。海马体与大脑记忆有关，并且对脑缺血敏感Cio7。大量实验结果表明海马CA1区椎体神经元细胞的死亡会引起啮齿类、灵长类动物以及人类出现认知功能障碍。因此，海马CA1区锥体细胞对学习和记忆能力至关重要，然而CA1区对脑缺血尤为敏感，会引起严重的学习和记忆功能退化。病理实验结果表明，VD模型组小鼠的大脑海马CA 1区锥体细胞大量缺失、变性、坏死，并且齿状回颗粒细胞变性成空泡样。毛冬青提取物可阻止CA1区锥体细胞缺失，从而起到保护海马区神经细胞，改善VD小鼠学习记忆的作用。
细胞凋亡在缺血再灌注损伤中具有重要的作用, Bcl -2 ,Bax属于Bcl -2家族蛋白，调控细胞凋亡。Bc}2属于抑凋亡蛋白，可以阻止细胞色素C从线粒体释放到胞浆。B ax属于促凋亡蛋白，通过移位到线粒体膜上促进细胞凋亡，促进细胞色素C的释放。Bc}2通过平衡Bcl -2 ,Bax维持线粒体结构稳定。结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠海马区Bcl -2与B ax蛋白表达均有所升高，可能为小鼠大脑间断缺血后，促凋亡蛋白B ax表达增加，诱导细胞凋亡，同时由于细胞自身的保护机制，抗凋亡蛋白Bc}2表达反应性上调，发挥抑制凋亡的作用。由于Bcl -2 ,Bax的比例决定细胞在受到凋亡信号刺激后是否发生凋亡，在VD小鼠模型中，B ax蛋白的表达占优势，从而导致海马区神经元细胞凋亡，海马区形态受损，记忆力出现障碍;与模型组比较，毛冬青提取物能够提高Bcl -2的表达，降低B ax的表达，从而显著提高Bc}2启ax的比值，使海马CA1区细胞的凋亡受到抑制。因此，毛冬青提取物可以通过调节海马CA 1区Bcl -2 ,Bax的表达，抑制CA1区的细胞凋亡，从而改善VD模型小鼠的学习记忆能力。
毛冬青已被广泛应用于心血管系统疾病的治疗，疗效确切。近年来，也有学者深入探讨毛冬青对脑组织损伤的保护作用。本实验结果表明，毛冬青提取物在高剂量时，改善VD小鼠学习记忆障碍的效果与尼莫地平相似，可通过抑制VD模型小鼠的脑组织海马区细胞凋亡来提高学习记忆能力，有望发展成为一种新的治疗血管性痴呆药物。
