单抗药物的分子质量、氨基酸序列以及糖基化位点鉴定 一
1. 前言
单抗药物主要是由两条重链和两条轻链通过链内和链间二硫键以及非共价键组成，分子质量大约在 150 kD 左右，每条重链和轻链在 N 端都包含一个可变区域，在 C 端都包含一个恒定区域，并且在每条重链上还存在一个 N 糖基化位点，该位点含有不同的糖链结构，如图 1 所示。目前，在生物制药领域中，单抗药物以其高效的治疗靶向性和特异性，越来越受到制药公司和医疗单位的青睐。为了保证单抗药物的有效性，以及单抗药物生产过程的实时监控，对于单抗药物的整体分子质量的测定、氨基酸序列的鉴定，糖基化位点的确认，二硫键的定位，糖链结构的解析等重要的分析技术，越来越受到制药公司的关注。随着生物质谱技术的不断发展和推广，基于生物质谱的单抗分析技术也开始全面、快速的开展起来。
目前，LTQ-Orbitrap Elite 组合式质谱仪结合了以前的双压线性离子阱质谱仪和新型高场 OrbitrapTM 质量分析器，提高了 MS和 MSn 的性能和多功能性。该系统具有高于 240,000 的分辨率（FWHM）、更高的灵敏度、高扫描速度和更大的动态范围，同时结合了多种碎裂技术，为深度复杂样品分析，包括蛋白质组学、代谢组学、脂类组学等样品的鉴定，翻译后修饰和定量分析，提供了全面、高效和快速的质谱分析平台。
图 1. 单抗药物的简单结构示意图（V 表示可变区域，C 表示恒定区域，L 表示轻链，H 表示重链。）
2. 实验部分
2.1 分子质量测定
2.1.1 仪器和试剂
质谱仪器：LTQ-Orbitrap Elite（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱仪器：Accela 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱柱：BioBasic 色谱柱（C8, 1×100 mm，5μm，300 Å）
（赛默飞世尔科技，美国）；
试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸。
2.1.2 仪器方法
色谱分析条件：具体见表 1；
质谱分析条件：具体见表 2；
2.1.3 数据分析方法
采用 Protein Deconvolution 2.0 软件对原始质谱图进行去卷积处理，得到完整的蛋白质分子质量信息。
表 1. 单抗分子质量测定的色谱分析条件
表 2. 单抗分子质量测定的质谱分析条件
2.2 氨基酸序列测定
2.2.1 仪器和试剂
质谱仪器：LTQ-Orbitrap Elite（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱仪器：Easy-nLC 1000液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱柱：Nano 色谱柱（C18，75μm × 150 mm，2 μm,100Å）（赛默飞世尔科技，美国）；
试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸，PNGaseF 内切糖苷酶，二硫苏糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），trypsin 内切蛋白酶。
2.2.2 仪器方法
色谱分析条件：具体见表 3；
