单抗药物的分子质量、氨基酸序列以及糖基化位点鉴定 二
质谱分析条件：具体见表 4；
表 3. 氨基酸序列测定的色谱分析条件
表 4. 氨基酸序列测定的质谱分析条件
2.2.3 数据分析方法
采用 Proteome Discoverer 1.3 软件对原始谱图进行数据库搜索，具体搜库参数为：包含单抗氨基酸序列的数据库；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）设置为固定修饰；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）脱氨基化（+0.984Da）设置为可变修饰；trypsin 设置为酶；酶漏切位点为 2。设置肽段的置信水平为 99%，得到高置信的鉴定肽段和蛋白结果。
2.2.4 样品前处理方法
将单抗样品首先进行 PNGaseF 酶解，切除糖链后的蛋白质，再进行 DTT 还原和 IAA 烷基化，最后进行 trypsin 过夜酶解。
2.3 糖基化位点测定
2.3.1 仪器和试剂
质谱仪器：LTQ-Orbitrap Elite（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱仪器：Easy-nLC 1000 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱柱：Nano 色谱柱（C18，75 μm× 150 mm，2 μm,100Å）（赛默飞世尔科技，美国）；
试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸，二硫苏糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），trypsin 内切蛋白酶。
2.3.2 仪器方法
色谱分析条件：具体见表 3；
质谱分析条件：具体见表 4；
2.3.3 数据分析方法
采用 Byonic 1.1 软件对原始谱图进行数据库搜索，具体搜库参数为：包含单抗氨基酸序列和 N 糖基化结构的数据库；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）设置为固定修饰；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）脱氨基化（+0.984Da）设置为可变修饰；trypsin 设置为酶；酶漏切位点为 2。最终通过人工确认，得到准确的糖基化修饰肽段的鉴定信息。
3. 结果与讨论
3.1 蛋白质分子质量测定
基于高分辨质谱 LTQ-Orbitrap Elite，为了保证采集谱图的质量和数量，我们设定高场 Orbitrap 检测器的采集分辨率为15,000。
经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的单抗原始质谱谱图如图 2-A所示，我们可以观察到不同的电荷分布的质谱图，选取强度最高的 m/z 为 2744.0384 的一组质谱峰为例，放大之后的质谱峰如图 2-B 所示，可以看到质谱图的灵敏度和信噪比都很高。
图 2. LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的单抗原始质谱图（A 为整体分布图，B 为 m/z 为 2744.0384 的放大图。）
