小鼠β-actin基因的克隆表达（1）
动物组织RNA的提取
实验目的：掌握由动物组织中提取总RNA的方法
实验原理：Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA则分布在上层的水相中，最后用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，这样就可以得到比较纯净的总RNA.
实验步骤：
① 先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。
② 室温放置5min，然后加入200µl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。
③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。
④ 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。重复操作一次。
⑤ 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µl
DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
另外，还可以通过试剂盒提取总RNA， 操作步骤见试剂盒说明。
RT-PCR扩增目的基因及琼脂糖电泳分析
实验目的：掌握通过RT-PCR方法由真核生物的总RNA中获得目的基因的方法，并通过琼脂糖电泳对扩增结果进行定性检测。
实验原理：由于真核生物的mRNA的3′端存在 Poly(A)尾，这样以olig（dT）为引物，在逆转录酶的催化下，就可以合成互补DNA（cDNA），然后以cDNA为模板，利用目的基因扩增引物进行PCR就可以扩增出目的基因。
实验步骤：
RNA的反转录
① 在小EP管中依次加入
RNA模板 3 μl
Olig（dT）18引物 1μL
DEPC H2O 8 μL
混合后，70℃水浴5 min（破坏二级结构），再冰浴5min。
② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL)：
RT 5×buffer 4μL
RNasin 1μL
dNTP ( 10mM) 2μL
混匀，37℃ 5min。
M-MULV反转录酶 1 μL
置于 42℃水浴，1h。
③ 70℃保温5min（使酶失活）。
④ 于-20℃保存备用。
PCR扩增目的基因
以反转录产物为模板，克隆引物B1，B2为引物，利用rTaq酶进行扩增目的基因，用于后续连入克隆载体的操作，然后再以表达引物EB1，EB2为引物，利用Pfu DNA聚合酶进行扩增目的基因，用于后续连入表达载体的操作。
94 ℃ 3 min
94 ℃ 45Sec
30 cycles: 57 ℃ 45Sec
72 ℃ 45Sec
72 ℃ 5min
扩增结果通过琼脂糖凝胶进行电泳检测
载体和外源DNA的连接反应
实验目的：为了实现DNA的体外重组，选择合适的限制性内切酶，对两者进行酶切，产生粘性末端，利用T4DNA连接酶将基因片段与载体连接起来，体外构建成重组DNA分子。
实验原理：
目的片段与T载体的连接反应
利用Taq酶除了聚合功能外，同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端，而在线性的T载体的5`端存在一个5`-T突出端，这样在高活力的T4DNA连接酶的作用下，在很短的时间那就能完成连接反应。
目的片段与表达载体的连接反应
已知在载体pGEX
4T-1上存在BamHⅠ和SalⅠ的单一限制性酶切位点，而在扩增目的片段时我们在引物的5`端人为引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，将它们同时进行双酶切，就可以产生互补的粘性末端。这样在T4DNA连接酶催化下，载体质粒与目的片段的粘性末端共价结合，环化为重组DNA分子。
