分子克隆-蛋白表达实验指南（二）
取DEPC水时切记带上手套
Genequant使用方法：
开机－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否为320nm)－set-ref(此时插入空白对照)－样品
1．使用前将比色皿中水吸出，用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽（先用1ml枪吸，后用100ul枪吸）。
2．加80ul水测对照
3．2ul RNA稀释40倍测浓度
4．测完后看RNA浓度（conc键），ratio值（ratio键）
4． 引物设计
利用VectorSuite NTI设计目的基因引物(克隆产物用于保存时，引物不用加酶切位点；用于表达蛋白时，引物两端须加上相应的酶切位点)
引物设计注意事项：
a． 所设计引物的rating值最好为171，两个引物的Tm值不能相差太大，最好在1C之内。Tm值应在50－70C之间，不能太小。
b． 设计好后，用NTI选择引物二聚体较少的primer，dimer最多不能超过8对。
c． 将NTI软件中的所有酶切位点全部加入。系统默认的酶切位点很少。
d． 目的基因片断中不能包含引物两端的酶切位点。
e． 酶切位点两端应加对应的保护碱基。
f． 对照相应的载体核对阅读框是否正确。注意载体a,b,c亚型ORF的区别。
g． 选择普遍表达、实验室有相关cDNA的基因或基因亚型。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed
h． 当表达载体的tag在C端时要注意插入片段后对tag读码框的影响。如his tag，要防止它因为读码框改变而变成Pro或Thr。
i． 核对读码框，保证质粒插入片断后不影响其MCS后面的终止子ORF，使融合蛋白能够有效的终止。
j． 目的片断的GC含量不能超过70%，最好65%以下。高GC值片断PCR不易成功
k． 3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配
每条引物合成2OD（1OD约为33µg）
引物稀释
每个引物稀释成10µmol/ml
所加水量＝3.3*10e6/MW µl
5． PCR
PCR退火用不带酶切位点和保护碱基那一段引物的退火温度。该温度可以用Vecter
NTI查询。用梯度PCR仪进行不同退火温度条件摸索。一般变动范围为8C即可。
Taq PCR摸复性温度
System(30µl):
10*reaction buffer(for Taq enzyme) 3µl
MgCl2 1.8µl
dNTP 1.5µl
primers As 1µl
Sp 1µl
cDNA 0.5µl
ddH2O 21µl
Taq 0.2µl
体系中cDNA和primers的量可以根据实际情况进行调整。如：PCR不能拉出产物时可以增加cDNA量至1µl。
