分子克隆-蛋白表达实验指南（六）
10. 测序
突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘－’符号，则人工对照测序图谱。
测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽，50ul，conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存，蛋白表达完成后一并提交存档。
获得GS后，即可构建含GE的重组T载体，用于表达。GE T载体的构建与GS T载体构建步骤相同(GS的引物需加酶切位点和保护碱基)
若序列正确，应及时保存相应的质粒及细菌(DH5α)。保存要求：小抽质粒50ul，细菌0.6~1.0ml于30％甘油中。
菌种保存及复苏
保存：
在0.6ml过夜培养物中加入0.2ml灭菌的60%甘油。Vortex以确保甘油分散均匀。置于-70C保存
复苏：
用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面，立即将黏附在接种环上的细菌划在含有适当抗生素的LB平板表面。将冻结的培养物放回-70C冻存，平板于37C培养过夜.
表达质粒构建
表达质粒构建概括而言即是将GE上的目的基因插入pET28、30等表达载体上。一般插入至少2个表达载体上，提高蛋白表达的概率。
11．T载体和表达载体双酶切
System（20ul）
表达载体 12ul
双酶切buffer 2ul
限制性酶a/b 1/1ul
ddH2O 4ul
T载体双酶切10ul体系即可；表达载体切20ul体系。
37。C水浴30min～1h
有些限制性酶buffer需要加BSA，视情况而定。
双酶切后跑电泳，胶回收相应条带，进行连接反应。
12. 酶切产物的连接
System（10ul）
10×连接缓冲液 1μl
PCR目的片断双酶切产物 5μl
空质粒双酶切产物 2μl
T4 DNA连接酶 0.5μl
ddH2O 1.5μl
16C连接3h以上，一般3h后即可用于转化。也可置于4C连接过夜。
如T载体双酶切的目的基因条带比较淡，可以增加体积至6.5ul连接。连接时表达载体的量应该少于T载体双酶切产物的量，使之充分连接。
13．连接产物转化DH5α（预开42C水浴）
与T载体转化相同，先转化DH5α，筛选及扩增目的重组质粒
转化DH5α后挑6～8个菌落验证，验证项目：
1． 目的基因引物PCR验证
2． 表达载体引物PCR验证
3． Step2中PCR产物胶回收后，以胶回收为模板、基因引物进行nest PCR
4． 小抽双酶切验证
验证后再小量抽提质粒，保存50ul质粒及相应的DH5α细菌
小抽重组质粒转化表达菌BL21。转化BL21后只需基因引物PCR验证
