分子克隆-蛋白表达实验指南（十）
13．连接产物转化DH5α（预开42C水浴）
与T载体转化相同，先转化DH5α，筛选及扩增目的重组质粒
转化DH5α后挑6～8个菌落验证，验证项目：
1． 目的基因引物PCR验证
2． 表达载体引物PCR验证
3． Step2中PCR产物胶回收后，以胶回收为模板、基因引物进行nest PCR
4． 小抽双酶切验证
验证后再小量抽提质粒，保存50ul质粒及相应的DH5α细菌
小抽重组质粒转化表达菌BL21。转化BL21后只需基因引物PCR验证
目的基因表达
14．快速诱导表达
快速诱导目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白，并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。
5． 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。
6． 37C，1mM
IPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接种，37C培养时，细菌生长至OD600＝0.4-0.6约需2h）时加入终浓度为1mM的IPTG。
7． 诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1ml OD600为0.4的菌加40ul
buffer)加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样。
8． 根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶。（50KD蛋白10％或12％）
9． 诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入相应体积的2×上样缓冲液，vortex。
10． 将收集的菌液在水中煮5min，上样10μl ，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。
11．
取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是新配的，染20min就够了），脱色液脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。
注意：
a.记录诱导后菌液的OD600
b.SDS-PAGE结果确定蛋白诱导后，再进行低温小量蛋白表达
c.制备的两个重组表达载体可同时进行快速诱导
